非洲猪瘟病毒p72蛋白原核表达及单克隆抗体制备

来源：中国畜牧兽医杂志2023年第11期北京时间：

作者：陈桂娥, 容芳, 冯夏宁, 孙荣航, 马绍钊, 郝文茜, 叶子安, 刘郁夫, 李作生, 陈瑞爱

单位：1. 岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心, 肇庆 526238;2. 华南农业大学兽医学院, 广州 510642;3. 肇庆学院生命科学学院, 肇庆 526060;4. 华农(肇庆)生物产业技术研究院有限公司, 肇庆 526238;5. 肇庆大华农生物药品有限公司, 肇庆 526238

摘要：【目的】表达与纯化非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）p72蛋白，并制备其单克隆抗体。【方法】构建原核表达载体pET-28b-p72，转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞并进行诱导表达和蛋白纯化；用纯化后的p72蛋白免疫BALB/c小鼠，将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合并制备单克隆抗体，通过间接ELISA法和亚克隆筛选出分泌抗体的阳性杂交瘤细胞；通过小鼠抗体类型检测试剂盒检测抗体类型；通过体内诱生法制备抗ASFV p72蛋白的单克隆抗体腹水，使用饱和硫酸铵沉淀法进行抗体纯化，通过间接ELISA法、间接免疫荧光试验（IFA）和Western blotting检测单克隆抗体效价和特异性。【结果】ASFV p72重组蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达，将纯化的p72蛋白制备单克隆抗体，获得4株分泌IgG1抗体的单克隆细胞株，分别命名为6F8、7C3、8H7和9G2。间接ELISA结果显示，6F8与8H7细胞株分泌的抗体效价均为1：64 00，7C3与9G2细胞株的抗体效价均为1：12 800，且4株细胞株分泌的抗体与p72蛋白反应结果均呈阳性，与猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）、猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）和猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）反应均呈阴性。4株单克隆细胞株分泌的抗体均能与p72真核蛋白发生特异性反应。【结论】本研究成功制备了4株能稳定分泌与ASFV p72蛋白特异性结合的单克隆抗体的细胞株，为进一步探究ASFV p72蛋白的功能以及非洲猪瘟的防控和诊断建立了基础。

关键词：非洲猪瘟病毒;p72蛋白;原核表达;单克隆抗体

基金资助：岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心自主项目（P20211154-0201）；肇庆市重点领域研发计划"揭榜制"项目（2021C001）