牛支原体重组蛋白P48原核表达、多克隆抗体制备及间接ELISA抗体检测方法的建立

来源：中国畜牧兽医杂志2023年第11期北京时间：

作者：张妍, 战力源, 姜福洁, 马红霞, 孔令聪

单位：1. 吉林农业大学动物医学院, 长春 130118;2. 吉林省新兽药研发与创制重点实验室, 长春 130118;3. 生物反应器与药物开发教育部工程研究中心, 长春 130118

摘要：【目的】建立牛支原体抗体间接ELISA检测方法，为牛支原体灭活疫苗的效力检测提供方法。【方法】构建pET-32a-P48原核表达质粒，转化大肠杆菌BL21（DE3）Plyss感受态细胞筛选阳性质粒并进行双酶切验证，用终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导重组蛋白表达，使用镍柱进行蛋白纯化，经SDS-PAGE验证蛋白纯度及分子质量大小，采用Western blotting检测重组P48蛋白特异性和反应原性；将重组P48蛋白免疫家兔制备多克隆抗体。建立牛支原体间接ELISA抗体检测方法并进行条件优化，确定阴阳性临界值。对建立的方法进行敏感性、稳定性、特异性及与平板凝集试验的符合率试验检测。【结果】经SDS-PAGE验证，P48蛋白分子质量大小为62.68 ku，纯度在90%以上；Western blotting检测结果显示，P48蛋白仅与相应抗体结合呈现单一条带，该蛋白特异性和反应原性良好；琼脂扩散方法测得阳性血清效价为1：64。建立的间接ELISA检测方法条件优化结果为：抗原包被浓度为0.3 μg/mL，1% BSA 37 ℃封闭120 min，待检血清按1：1 280稀释，37 ℃孵育60 min，二抗稀释度为1：5 000，37 ℃孵育60 min，邻苯二胺常温显色10 min。结果判定标准为：D492 nm值>0.3196为阳性；D492 nm值<0.3101为阴性；0.3101≤D492 nm值≤0.3196为可疑。敏感性试验结果显示，当阳性样品稀释度为1：218时，阳性血清判读结果仍为阳性。稳定性试验结果显示，3批次P48蛋白包被的96孔板检测结果的变异系数均<10%；与牛溶血性曼氏海姆杆菌、牛巴氏杆菌阳性血清无交叉反应。本试验建立的间接ELISA抗体检测方法与平板凝集试验阳性血清符合率为100%（18/18），阴性血清符合率为97.5%（39/40）。【结论】本研究建立的牛支原体P48间接ELISA抗体检测方法具有良好的敏感性、特异性及稳定性，为牛支原体抗体检测及牛支原体疫苗效力检测提供了方法。

关键词：牛支原体;P48蛋白;间接ELISA

基金资助：吉林省科技发展计划项目（202537NY010575934）；中国工程院战略研究与咨询项目（JL2023-07）