猫球形马拉色菌脂肪酶SMG1基因的真核表达及重组载体脂肪酶活性分析

来源：中国畜牧兽医杂志2024年第5期北京时间：

作者：王开开, 赵懿侔, 张含露, 邱实, 刘艺佳, 张文鑫, 杨丰利

单位：长江大学动物科学技术学院, 荆州 434025

摘要：【目的】马拉色菌(Malassezia)是引起猫外耳炎的病因之一,具有脂质依赖性,脂肪酶SMG1基因能调控球形马拉色菌脂肪酶的合成。本研究旨在构建脂肪酶SMG1基因毕赤酵母表达载体,获得SMG1基因重组表达产物,并对脂肪酶酶活性进行分析,为后续马拉色菌脂肪酶SMG1基因功能研究提供依据。【方法】对1例疑似猫马拉色菌性外耳炎病例的致病菌进行真菌分离鉴定,并通过相似性比对确定菌种类型;利用DNAworks软件优化脂肪酶SMG1基因,构建克隆载体并鉴定;使用毕赤酵母表达系统构建SMG1基因真核表达载体,并对重组表达载体进行筛选及鉴定;对重组载体脂肪酶活性进行测定。【结果】试验成功从疑似患有马拉色菌性外耳炎的患猫耳道中分离得到1株马拉色菌菌株,鉴定为球形马拉色菌;通过对马拉色菌脂肪酶SMG1基因密码子的优化,将密码子适应指数(codon adaptation index,CAI)提高至0.95;成功构建脂肪酶SMG1基因克隆载体,成功构建重组质粒pGAPZαA-SMG1并转入毕赤酵母X33中,诱导表达后使用SDS-PAGE分析,蛋白产物大小为35 ku,脂肪酶酶活性测定为0.023 U/mL;重组脂肪酶SMG1在30 ℃酶活性最高(0.027 U/mL),与40、45 ℃组间差异均极显著(P＜0.01)。【结论】球形马拉色菌在猫耳道皮肤温度附近有较高的脂肪酶活性,同时脂质促进了马拉色菌的生长;毕赤酵母表达系统可成功表达并分泌重组脂肪酶SMG1。试验结果为后续猫马拉色菌性外耳炎的致病机制研究、脂肪酶抑制剂研制及快速检测技术的开发奠定了基础。

关键词：猫;球形马拉色菌;脂肪酶;毕赤酵母;真核表达

基金资助：湖北省教育厅科学技术研究项目(D20191304)