新型阿卡斑病毒NSs蛋白生物信息学分析及多克隆抗体制备

来源：中国畜牧兽医杂志2024年第5期北京时间：

作者：蔡畅, 陈赫威, 宋瑞鹏, 覃绍敏, 刘金凤, 秦树英, 孙倩, 陈童锦悦, 欧长波, 刘兴友, 马玲, 吴健敏

单位：1. 广西壮族自治区兽医研究所, 广西兽医生物技术重点实验室, 南宁 530001;2. 河南科技学院动物科技学院, 新乡 453003;3. 农业农村部(广西)-东盟跨境动物疫病防控重点实验室, 南宁 530001;4. 广西大学动物科学技术学院, 南宁 530004;5. 新乡学院生命科学与基础医学学院, 新乡 453003

摘要：【目的】对新型阿卡斑病毒(Akabane virus,AKAV)非结构蛋白(non-structura,NSs)进行生物信息学分析,进而制备抗多克隆抗体,为新型AKAV检测及功能研究提供必要材料。【方法】使用蛋白生物信息学在线分析网站,对新型AKAV NSs蛋白进行系统分析。克隆NSs全长基因,利用大肠杆菌表达系统表达NSs重组蛋白,优化蛋白诱导条件并分析重组蛋白的可溶性;收获破碎菌体,经8 mol/L尿素变性、Ni2+-NTA亲和层析纯化、透析及浓缩后进行SDS-PAGE、Western blotting鉴定;将纯化的重组NSs蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体;应用间接ELISA、Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)测定多克隆抗体效价及特异反应性。【结果】生物信息学分析表明,NSs蛋白由91个氨基酸残基构成,等电点为12.10,属于碱性蛋白,不稳定指数约为79.04,平均亲水性为指数为―0.059,为不稳定的亲水蛋白;无跨膜区和信号肽,属于非分泌蛋白。试验成功构建了NSs蛋白原核表达载体pET-32a-NSs,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定显示,成功表达重组NSs蛋白,分子质量为29.3 ku,主要以包涵体形式存在,与生物信息学分析结果一致;制备的多克隆抗体效价可达1∶16 384 000,Western blotting和IFA结果表明所制备抗体能够与NSs蛋白发生特异性反应,具有较好的特异性。【结论】试验成功获得纯化的新型AKAV NSs蛋白,该蛋白具有较好的免疫原性;制备获得效价高、特异性好的多克隆抗体,为后续新型AKAV疫苗开发、检测及NSs蛋白功能研究提供了基础。

关键词：新型阿卡斑病毒(AKAV);NSs蛋白;生物信息学;原核表达;多克隆抗体

基金资助：国家自然科学基金(32160830);广西兽医生物技术重点实验室开放基金项目(20-065-23-B-2);广西兽医研究所基本科研业务费专项(桂科专项20-4、桂科专项21-7)