山羊circFDXR的鉴定及其在卵巢颗粒细胞中高效表达的研究

来源：中国畜牧兽医杂志2024年第6期北京时间：

作者：刘杰, 李之瀚, 郭聪慧, 冯光杭, 薛文哲, 刘德武, 柳广斌, 孙宝丽, 郭勇庆, 邓铭, 邹娴, 李耀坤

单位：1. 华南农业大学动物科学学院, 广州 510642;2. 华南农业大学畜禽育种国家地方联合工程研究中心, 广州 510642;3. 华南农业大学广东省农业动物基因组学与分子育种重点实验室, 广州 510642;4. 广东省农业科学院动物科学研究所, 畜禽育种国家重点实验室, 广东省畜禽育种与营养研究重点实验室, 广州, 510640

摘要：【目的】鉴定山羊环状RNA(circular RNA,circRNA)铁氧还蛋白还原酶(circFDXR)的表达,建立其在山羊原代卵巢颗粒细胞中的高效表达方式。【方法】利用PCR扩增、DNA测序、RNase R酶消化、实时荧光定量PCR鉴定circFDXR的环状性质。通过核质分离、荧光原位杂交(FISH)检测circFDXR亚细胞定位。利用同源重组将circFDXR的线性序列无缝克隆至慢病毒载体pLC5-ciR,转染至293T细胞包装病毒后进行病毒滴度测定,并确定最佳感染复数(MOI),并以最佳MOI感染山羊原代卵巢颗粒细胞,通过实时荧光定量PCR检测过表达效率,并测序验证circFDXR是否正确环化。【结果】山羊circFDXR主要定位于卵巢颗粒细胞的细胞质中,耐受RNase R酶的消化。成功构建circFDXR慢病毒过表达载体,浓缩病毒滴度为5.49×109 TU/mL,感染山羊卵巢颗粒细胞的最佳MOI为100。实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,过表达组circFDXR表达量极显著升高(P＜0.01),测序结果显示过表达的circFDXR可以正确环化。【结论】circFDXR主要定位于卵巢颗粒细胞的细胞质中,相比线性RNA具有更高的稳定性。利用慢病毒包装的circFDXR在山羊原代卵巢颗粒细胞中可以正确环化,本试验结果为进一步研究circFDXR在山羊原代卵巢颗粒细胞中的功能奠定了理论基础。

关键词：山羊;circFDXR;慢病毒包装;卵巢颗粒细胞

基金资助：广东省科技特派员项目(KTP20210344);广东省现代农业产业技术体系项目(2023KJ127)