利用CRISPR/Cas9编辑系统构建ACTA1基因敲除的PEFs细胞系

来源：中国畜牧兽医杂志2024年第6期北京时间：

作者：张雪萍, 刘嘉仪, 王彦芳, 吴添文

单位：1. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 畜禽生物育种全国重点实验室, 北京 100193;2. 甘肃农业大学动物科学技术学院, 兰州 730070;3. 西郊利物浦大学理学院, 苏州 215000

摘要：【目的】利用CRISPR/Cas9技术获得α-肌动蛋白1(actin alpha 1,ACTA1)基因敲除的猪胎儿成纤维细胞(porcine embryo fibroblasts,PEFs),为后续在细胞水平上探究猪ACTA1基因功能及发掘友好基因座位奠定基础。【方法】通过实时荧光定量PCR检测ACTA1基因在巴马小型猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背部皮下脂肪和背最长肌7种组织中的表达情况;利用CRISPOR在线网站在猪ACTA1基因第7外显子区域设计3条向导RNA(single guide RNA,sgRNA),并将其连接至pX330载体;通过T7E1酶切检测不同sgRNA活性,选择效率较高且符合目标的载体质粒共转染至PEFs中;利用有限稀释法筛选单克隆细胞,并对获得的单克隆细胞进行基因型鉴定和脱靶分析。【结果】实时荧光定量PCR结果表明,ACTA1基因在背最长肌中的表达量极显著高于其他组织(P＜0.01)。设计的3条sgRNA的基因编辑效率分别为24.87%(sgRNA1)、39.59%(sgRNA2)、36.93%(sgRNA3),综合切割位置和基因编辑效率,选用sgRNA1和sgRNA2共转染细胞。基因型鉴定结果表明,获得的69株单克隆细胞中有20株单克隆细胞发生了编辑,其中单等位基因片段敲除细胞3株,双等位基因片段敲除细胞1株,片段敲除效率为5.8%(4/69)。脱靶分析结果显示,在预测的脱靶位点未检测到脱靶效应。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑系统成功构建了ACTA1基因纯合敲除的PEFs,研究结果为进一步探究ACTA1基因对猪骨骼肌发育调控提供了技术支撑和理论基础,同时为挖掘猪组织特异性表达的友好位点提供新思路。

关键词：猪;CRISPR/Cas9;ACTA1基因')">ACTA1基因;猪胎儿成纤维细胞(PEFs)

基金资助：国家重点研发计划项目(2020YFA0509503);中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(2021-YWF-ZYSQ-08)