马脐静脉内皮细胞分离培养及其功能验证

来源：中国畜牧兽医杂志2024年第7期北京时间：

作者：赵比力格, 温鑫, 伊敏娜, 才文道力玛, 神英超, 斯琴, 照伦其其格, 任宏, 芒来, 格日乐其木格

单位：内蒙古农业大学动物科学学院, 内蒙古自治区马属动物科学研究与技术创新重点实验室, 呼和浩特 010020

摘要：【目的】建立一种简便且高效的体外马脐静脉内皮细胞(equine umbilical vein endothelial cells,eUVECs)分离和培养方法,并提供一个可靠的细胞模型,用于研究马的血管生成功能。【方法】在无菌条件下,从马脐带中分离静脉,并用PBS液彻底冲洗。使用0.2% Ⅰ型胶原酶对脐静脉进行消化25~30 min后,收集分离的eUVECs进行培养。每12 h使用倒置显微镜观察eUVECs的生长状况。使用CCK-8法测定第1代(P1)和P3代eUVECs在7 d内的D450 nm值,并绘制生长曲线。通过免疫荧光染色方法鉴定内皮细胞标记物CD31和CD34的表达情况。使用间充质干细胞成脂和成骨分化诱导试剂诱导eUVECs,以验证其是否具有分化特性。确定内皮细胞后,添加梯度上升浓度(5、10、15、20、25 ng/mL)的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激eUVECs,使用CCK-8法检测细胞活性,观察细胞形态变化。使用Matrigel法培养eUVECs,用ImageJ软件分析数据,并统计新生血管的4个指标:成管交叉点、成管长度、成管数和成管面积。寻找体外血管生成能力的最佳TNF-α刺激浓度。【结果】使用0.2% Ⅰ型胶原酶消化法分离的eUVECs 4~5 d内的汇合度达到90%。在倒置显微镜下观察,这些细胞生长良好并呈铺路石状排列。通过免疫荧光染色确认了CD31和CD34在eUVECs中的阳性表达;并且eUVECs表现出薄弱的成脂和成骨分化能力。在Matrigel法培养条件下,20 ng/mL TNF-α 处理组的成管交叉点数、成管长度、成管数和成管面积等血管形成能力指标最高,且极显著高于对照组(P＜0.01)。然而,在常规培养条件下,随着TNF-α浓度增加到15 ng/mL,eUVECs的增殖受到显著抑制甚至开始导致细胞的凋亡。【结论】Ⅰ型胶原酶脐带注满消化法能够成功分离培养出原代eUVECs,20 ng/mL TNF-α显著增强eUVECs体外血管生成能力,eUVECs可以作为体外研究血管生成的细胞模型。

关键词：马;脐静脉内皮细胞;Ⅰ型胶原酶消化法;培养鉴定;α')">TNF-α;血管新生

基金资助：内蒙古自治区自然科学基金(2023SHZR0557);内蒙古农业大学优秀博士引进人才科研启动项目(NDYB2022-42)