牛冠状病毒感染新生犊牛肺上皮细胞模型的建立

来源：中国畜牧兽医杂志2024年第8期北京时间：

作者：陈秋会, 蒋珊珊, 高萌萌, 夏立勇, 张国华, 任亚超, 周玉龙

单位：1. 黑龙江八一农垦大学动物科技学院, 大庆 163319;2. 黑龙江省东宁市畜牧兽医服务总站, 东宁 157299;3. 黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院, 齐齐哈尔 161005;4. 天津理工大学, 天津 300382

摘要：【目的】牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)是犊牛腹泻和上呼吸道疾病的主要病原,目前缺少敏感的适合BCoV体外培养的本动物细胞,限制了BCoV致病机制的深入研究。因此,本研究拟从犊牛肺脏组织中分离出牛肺上皮细胞(bovine lung epithelial cell,BLEC)建立BCoV体外感染本动物细胞模型。【方法】采用胰蛋白酶和Ⅰ型胶原蛋白酶两步酶消化法对新生犊牛肺脏组织进行肺上皮细胞初步提取,再利用上皮细胞贴壁时间不同的差异贴壁法纯化BLEC。通过间接免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)检测纯化后细胞中标志细胞角蛋白18(cytokeratin 18,CK-18)的表达来鉴定BLEC,并通过PCR方法对细胞进行病原纯净性检测,包括牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)、牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)、BPIV5、牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)、BCoV和支原体(Mycoplasma)。通过PCR和IFA检测BCoV对BLEC的易感情况,并绘制BCoV在BLEC上的一步生长曲线。【结果】分离纯化培养的BLEC形态均匀稳定、呈菱形或砖块状,无常见病原BRV、BVDV、BPIV3、BPIV5、IBRV、BCoV和支原体污染,上皮细胞标志CK-18呈阳性表达。犊牛腹泻来源的BCoV HLJ-325毒株感染BLEC 24 h后可观察到明显的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE);PCR能扩增出BCoV N基因;IFA结果显示,BCoV感染BLEC呈现特异性红色荧光。通过实时荧光定量PCR检测BCoV 含量建立病毒生长曲线,BCoV在感染BLEC后20 h时病毒载量最高,为4.46×105拷贝/mL。【结论】本研究成功分离制备了BLEC,证明BCoV易感染BLEC,构建了BCoV体外感染BLEC模型,为研究BCoV引起牛呼吸道疾病的致病机制奠定基础。

关键词：牛冠状病毒(BCoV);牛肺上皮细胞;分离纯化;感染模型

基金资助：黑龙江省自然基金联合引导项目(LH2020C083);黑龙江省大学生创新创业训练计划项目(202310223018);黑龙江省"揭榜挂帅"科技攻关项目(2023ZXJ02B03);中央引导地方科技发展专项标准化养殖产业扶贫示范项目(ZY18C07)