PEDV、TGEV与PDCoV S蛋白表位基因三联疫苗的构建及其鉴定

来源：中国畜牧兽医杂志2024年第8期北京时间：

作者：刘青, 顾天越, 包利霞, 朱凡杰, 王鑫源, 刘婷婷, 朱晓琛, 鄢明华, 董志民, 王利丽, 张东超, 金天明

单位：1. 天津农学院动物科学与动物医学学院, 天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室, 天津 300392;2. 天津市畜禽分子育种与生物技术重点实验室, 天津 300381;3. 天津市农业科学院畜牧兽医研究所, 天津 300381;4. 农业农村部智慧养殖重点实验室(部省共建), 天津农学院, 天津 300392

摘要：【目的】构建一种同时预防猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的三联表位疫苗,以预防上述病原导致的猪的相关疾病。【方法】本研究运用免疫信息学在线软件对3种猪肠道冠状病毒(SeCoVs)的S蛋白B、T细胞表位进行预测分析,构建新的表位肽段,命名为PPT,通过ExPASy、VaxiJen、TMHMM、SOPMA、SOLpro和AlphaFlod2等在线软件对PPT进行生物信息学分析,并利用C-IMMSIM在线软件对其免疫反应进行模拟。通过T2A将PPT与PEDV的COE序列、TGEV的SAD序列及PDCoV的CTD序列连接并构建至真核表达载体pEGFP-N1,经PCR和双酶切鉴定正确后,将获得的重组质粒转染HEK293A细胞,经DAPI染色、CCK8、RT-PCR及Western blotting试验验证重组质粒在体外表达情况。【结果】构建的表位蛋白PPT由17条表位肽段组成,经生物信息学软件分析,该蛋白为非跨膜蛋白,结构稳定,具有抗原性和可溶性,亲水性高,无过敏性。C-IMMSIM结果显示,PPT能引起机体树突状细胞(DC)增加,B、T细胞免疫反应,刺激免疫球蛋白IgG、IgM和细胞因子γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)水平升高。重组质粒经PCR和双酶切鉴定结果显示,分别在3 359、2 375、1 064、944、764和467 bp出现特异性目的条带,与预期相符;重组质粒转染HEK293A细胞后,可见绿色荧光;RT-PCR扩增分别在3 359、2 375、1 064、944、764和467 bp处获得与目的基因大小相符的条带;CCK-8检测结果表明,重组质粒对细胞均无明显毒性作用;Western blotting检测结果显示,分别在31.7、16.1、37.9和27.5 ku处出现与目的蛋白分子质量大小一致的条带,重组质粒成功在HEK293A细胞中表达。【结论】本研究基于计算机软件分析设计的PPT表位蛋白成功构建三联疫苗,且在体外表达,为评价PEDV-TGEV-PDCoV三联表位疫苗的免疫效果提供依据。

关键词：猪流行性腹泻病毒(PEDV);猪传染性胃肠炎病毒(TGEV);猪德尔塔冠状病毒(PDCoV);S蛋白;表位疫苗

基金资助：国家自然科学基金青年基金资助项目(32202760);甘肃省科技计划项目(22CX8NL215);天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室开放基金课题资助项目(2020zdkf02);农业农村部智慧养殖重点实验室(部省共建)开放基金资助(2023-TJAUKLSBF-2103)