CD163基因敲除iPAMs的构建及其感染PRRSV的特征分析

来源：中国畜牧兽医杂志2024年第8期北京时间：

作者：董泽霞, 林鑫, 周期律, 王楠, 黄雷, 刘志国, 冯政, 牟玉莲

单位：1. 佛山大学生命科学与工程学院, 佛山 528225;2. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193;3. 天津农学院动物科学与动物医学学院, 天津 300392;4. 中国农业科学院农业基因组研究所, 深圳 518120

摘要：【目的】获得分化抗原163(cluster of differentiation 163,CD163)基因敲除的永生化猪肺泡巨噬细胞系(immortalized porcine alveolar macrophages,iPAMs),并从细胞水平研究CD163蛋白在猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)入侵过程中的作用。【方法】将靶向CD163基因第7外显子的sgRNA质粒(pX330-sgCD163)转染至iPAMs,转染48 h后通过有限稀释法筛选单克隆细胞并进行基因型鉴定,通过Western blotting和脱靶分析来筛选CD163基因敲除的iPAMs;通过实时荧光定量PCR、Western blotting、间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)和半数细胞培养物感染量(50% tissue culture infective dose,TCID50)等试验分析CD163基因敲除的iPAMs感染PRRSV的特征。【结果】测序结果表明,100株单克隆细胞中有1株CD163双等位基因敲除的iPAMs,敲除效率为1%;Western blotting结果显示,CD163基因敲除的iPAMs中检测不到CD163蛋白的表达,且在预测的脱靶位点未检测到脱靶效应。实时荧光定量PCR结果表明,与野生型iPAMs组相比,CD163基因敲除的iPAMs组病毒拷贝数极显著降低(P＜0.01);Western blotting和IFA结果表明,在接毒24 h后的CD163基因敲除的iPAMs组中未检测到PRRSV-N蛋白的表达;TCID50试验结果同样显示,在CD163基因敲除的iPAMs组中未观察到细胞病变。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9编辑系统成功构建了CD163基因敲除的iPAMs,该细胞系可以完全抵抗PRRSV感染。该细胞系的建立为后续研究PRRSV与CD163蛋白的互作机制提供了新型试验材料。

关键词：CRISPR/Cas9;CD163基因')">CD163基因;永生化猪肺泡巨噬细胞系(iPAMs);猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)

基金资助：天津市科技计划项目(22ZXZYSN00030);抗病猪新品种设计与培育(2023ZD04043);中国农业科学院科技创新工程(ASTIP-IAS05)