基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒快速检测方法的建立

来源：中国畜牧兽医杂志2024年第8期北京时间：

作者：于晶雪, 韦珊珊, 覃绍敏, 吴健敏, 杨丽华, 陈凤莲, 许力士, 秦树英, 华俊, 韦珏, 方芳, 刘金凤

单位：1. 广西大学动物科学技术学院, 南宁 530004;2. 广西壮族自治区兽医研究所, 广西兽医生物技术 重点实验室, 农业农村部(广西)东盟跨境动物疫病防控重点实验室, 南宁 530001

摘要：【目的】本研究将CRISPR/Cas12a系统与反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)结合,拟建立一种基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)快速检测方法。【方法】分析不同基因型PRRSV全基因组序列,在3'-UTR端保守区设计重组酶介导等温核酸扩增技术(RAA)引物、crRNA及DNA报告底物分子,筛选RT-RAA最佳引物对。表达纯化AsCas12a蛋白,并以质粒为标准品,经RT-RAA扩增后,将产物加入CRISPR/Cas12a系统,建立PRRSV的CRISPR/Cas12a-RT-RAA检测方法,分别以PRRSV、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)核酸为模板验证建立方法的特异性,以不同浓度的pMD18T-PRRSV为模板验证建立方法的敏感性。以5.62×106、5.62×103、5.62拷贝数/μL的质粒为模板进行重复性试验,最后进行临床效果评价,将所建立的方法与实时荧光定量逆转录PCR方法进行比较。【结果】本研究成功表达并纯化获得具有良好剪切活性的AsCas12a蛋白,蛋白分子质量大小为196 ku;所建立的CRISPR/Cas12a-RT-RAA方法的检测下限可达5.62 拷贝/μL;该方法具有良好的特异性,可特异性检测出PRRSV,不能检出其他猪病病毒PCV2、PEDV、CSFV和PRV,并具有良好的重复性。应用该方法对121份猪组织样品进行检测,与实时荧光定量逆转录PCR的阳性符合率为93.75%,阴性符合率为99.05%,总符合率为99.17%。【结论】本研究成功建立基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的PRRSV快速检测方法,该方法特异性强、灵敏性高、重复性好且不依赖复杂设备,可在现场和基层实验室使用。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV);反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA);CRISPR/Cas12系统

基金资助：南宁市重点研发计划(20232049);广西基本科研业务费(23-7);广西兽医生物技术重点实验室项目(19-50-40-B-03、22-035-32-B-03)