牛早幼粒细胞白血病蛋白的原核表达及单克隆抗体制备

来源：中国畜牧兽医杂志2024年第9期北京时间：

作者：程晶, 陈沛霖, 郭禹, 崔锦蔷, 江波, 周林宜, 刘文晓, 李焕荣, 李永清

单位：1. 北京市农林科学院畜牧兽医研究所, 北京 100097;2. 北京农学院动物科学技术学院, 北京 102206;3. 河北农业大学动物医学院, 保定 071001

摘要：【目的】 牛早幼粒细胞白血病蛋白(promyelocytic leukemia protein，PML)是细胞核亚结构PML核体(nuclear bodies，NBs)的骨架蛋白，在抗病毒内源性免疫中发挥重要作用。本研究旨在制备牛PML单克隆抗体，为研究PML NBs结构和功能准备物质材料。【方法】 构建表达bPML基因截短体的重组质粒pET-32a-bPML，将重组质粒转化大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞，IPTG诱导表达，利用SDS-PAGE和Western blotting对表达产物进行分析。将经镍柱亲和层析纯化后的重组蛋白免疫小鼠，制备单克隆抗体，应用ELISA方法鉴定单克隆抗体类/亚类和型，进一步鉴定该单克隆抗体识别的抗原表位；通过检测不同种属来源的细胞检测单克隆抗体的特异性；利用该单克隆抗体对外源转染牛PML的细胞进行Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)检测；利用该单克隆抗体建立的IFA检测不同的牛源细胞内源PML定位情况。【结果】 牛PML在大肠杆菌中可溶性表达，分子质量大小为50 ku；以此纯化蛋白为免疫原制备出1株抗牛PML单克隆抗体bPML-2G5，其为IgG1亚类，轻链为Kappa型，识别表位位于牛PML结构域78EQPRPSTSRA88；Western blotting和IFA分析结果显示，bPML-2G5不仅可特异性识别外源转染的牛PML，而且还能特异性识别牛肾细胞、牛鼻甲骨细胞、牛胚气管细胞的胞核内核体结构中的PML。【结论】 本研究成功制备了1株分泌牛PML单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其分泌的单克隆抗体可用于检测外源性及内源性表达的牛PML。

关键词：牛早幼粒细胞白血病蛋白;原核表达;蛋白纯化;单克隆抗体

基金资助：国家自然科学基金(3217190008)