猪NLRC5的真核表达及多克隆抗体制备

来源：中国畜牧兽医杂志2024年第10期北京时间：

作者：马梦瑶, 贾鑫浩, 刘航, 钱梦薇, 郑兰兰

单位：1. 河南农业大学动物医学院, 郑州 450046;2. 动物病原与生物安全教育部重点实验室, 郑州 450046

摘要：【目的】 NOD样受体家族成员C5(NLRC5)在哺乳动物中广泛表达，并参与调节免疫应答和抗原递呈过程。试验通过真核表达系统表达猪NLRC5基因重组表达产物，并制备猪NLRC5多克隆抗体,为后续研究猪NLRC5的分子机制提供基础支撑。【方法】 通过生物信息学在线网站分析NLRC5蛋白的跨膜结构和信号肽。采用PCR方法扩增猪NLRC5基因，构建真核表达载体pCAGGS-HA-NLRC5，并将其转染至HEK-293F细胞。利用Western blotting检测重组蛋白表达，并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。使用间接ELISA法测定多克隆抗体效价，并检测抗体特异性。采用间接免疫荧光法(IFA)和Western blotting检测NLRC5多克隆抗体与不同细胞的反应原性。以NLRC5多克隆抗体为一抗，通过Western blotting检测经siRNA处理后ST细胞中NLRC5蛋白的表达情况。【结果】 生物信息学分析结果显示，NLRC5蛋白不存在跨膜结构域，含有1个信号肽；试验成功构建真核表达质粒pCAGGS-HA-NLRC5。Western blotting结果显示，成功表达NLRC5蛋白，分子质量约203 ku；制备的NLRC5多克隆抗体效价为1∶25 600，且具有良好的特异性。IFA和Western blotting结果表明该抗体能够与多种细胞系发生特异反应；siRNA技术验证其能用于检测细胞中NLRC5的表达。【结论】 本研究利用真核表达系统成功获得猪NLRC5重组蛋白并制备兔源多克隆抗体，为下一步探究NLRC5在先天免疫反应中对外来感染的防御作用提供试验材料。

关键词：NLRC5;猪;真核表达;多克隆抗体

基金资助：国家重点研发计划项目子课题(2021YFD1801105)；河南省自然科学基金(232300420014)