基于外膜蛋白的鼻气管鸟杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立

来源：中国畜牧兽医杂志2024年第10期北京时间：

作者：徐浩钧, 刘颖, 梅晨, 徐彤, 利凯, 王宏俊

单位：1. 北京市农林科学院畜牧兽医研究所, 北京 100097;2. 河北北方学院, 张家口 075000

摘要：【目的】 建立鼻气管鸟杆菌(Ornithobacterium rhinotracheale，ORT)血清抗体的ELISA检测方法。【方法】 利用原核表达方法克隆表达鼻气管鸟杆菌外膜蛋白OR02，经Western blotting鉴定其免疫原性。以纯化产物作为抗原包被于固相载体，采用棋盘滴定法确定抗原包被浓度和血清稀释度。同时，优化ELISA反应条件，利用鼻气管鸟杆菌阴性血清确定该检测方法的阴阳临界值判定标准。通过检测其他病原阳性血清评估该方法的特异性，检测不同比例稀释的鼻气管鸟杆菌阳性血清以评估其灵敏性，并与商品化试剂盒进行比较，评估该ELISA方法的符合率。【结果】 重组蛋白OR02以包涵体形式表达，分子质量约为58 ku，与预期相符。Western blotting显示，OR02重组蛋白能与鼻气管鸟杆菌阳性血清发生特异性结合，具有良好的免疫反应性。以纯化的OR02蛋白作为包被抗原，确定最佳抗原包被浓度为2 ng/μL，血清样本的稀释度为1∶50，孵育时间为30 min，酶标二抗的稀释度为1∶5 000，孵育时间为30 min，最佳底物显色条件为在避光条件下孵育15 min。阴阳临界值的判定标准为：当待检血清D450 nm值≥0.266时判定为阳性，当待检血清D450 nm值＜0.266时判定为阴性。用该方法检测副鸡禽杆菌(Apg)、新城疫病毒(NDV)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)等单因子阳性鸡血清均无交叉反应。将抗体滴度为1∶64的鼻气管鸟杆菌阳性鸡血清以1∶800稀释仍能检测到阳性结果。与商业试剂盒对相同临床样本的检测结果的符合率为91.25%。【结论】 本研究利用重组OR02蛋白建立了一种检测鼻气管鸟杆菌血清抗体的间接ELISA方法，该方法具有良好的特异性和灵敏性，且与商业试剂盒的符合率较高，可作为鸡血清鼻气管鸟杆菌抗体的检测工具。

关键词：鼻气管鸟杆菌;外膜蛋白;间接ELISA;特异性;灵敏性

基金资助：北京市自然科学基金(6212009)；北京市农林科学院改革与发展项目(XMS202411)