鸡Caspase 3基因的克隆表达、酶活性及生物信息学分析

来源：中国畜牧兽医杂志2024年第10期北京时间：

作者：陈扬, 项燕华, 李宜海, 何秀苗

单位：广西民族大学海洋与生物技术学院, 广西多糖材料与改性重点实验室, 南宁 530008

摘要：【目的】 构建鸡半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(chCaspase 3)基因表达载体，鉴定表达蛋白酶活性，并进行生物信息学分析，为后续研究chCaspase 3功能奠定基础。【方法】 以鸡法氏囊组织cDNA为模板，通过PCR扩增chCaspase 3基因，构建chCaspase 3基因的原核和真核表达载体。将原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，经IPTG诱导表达重组蛋白后利用Western blotting分析chCaspase 3原核表达产物。将真核表达载体以不同剂量(0、0.5、1.0、1.5、2.0 μg)转染DF-1细胞进行表达，利用Western blotting和间接免疫荧光技术(IFA)分析chCaspase 3真核表达产物。用Caspase 3活性检测试剂盒分别检测原核和真核表达蛋白的酶活性；利用生物信息学软件分析chCaspase 3的相似性，并预测chCaspase 3蛋白的结构域和三级结构。【结果】 chCaspase 3基因CDS区长852 bp,编码283个氨基酸。本研究成功构建了原核pET28a(+)-chCaspase 3和真核p3×Flag-CMV7.1-chCaspase 3重组质粒，原核表达产物分子质量为36 ku，与预期相符；真核表达产物表达量随转染的真核表达载体量的增加而增加。原核和真核表达产物均具有Caspase 3酶活性。生物信息学分析发现，chCaspase 3与其他物种相似性较低，且亲缘关系较远，chCaspase 3蛋白含有Caspase家族的保守五肽QACRG和经典的CASc结构域，其三维结构与人Caspase 3(hCaspase 3)十分吻合。【结论】 试验成功克隆并表达了chCaspase 3基因，重组蛋白具有Caspase 3酶活性，生物信息学预测chCaspase 3蛋白与hCaspase 3蛋白有相似的三维结构，为揭示chCaspase 3蛋白的功能及探索其抗病毒天然免疫机制奠定了基础。

关键词：Caspase3基因')">鸡Caspase3基因;原核表达;真核表达;酶活性;生物信息学

基金资助：国家自然科学基金项目(32160824)；广西自然科学基金项目(2022GXNSFAA035520)