沙门菌感染IPEC-J2细胞前后上清液外泌体鉴定及其m6A相关蛋白表达和转录组分析

来源：中国畜牧兽医杂志2024年第11期北京时间：

作者：张新国

单位：淮安市淮阴区动物疫病预防控制中心, 淮安 223001

摘要：【目的】 探究外泌体在沙门菌感染猪小肠上皮细胞(IPEC-J2 细胞)过程中的作用及分子调控机制。【方法】 利用间接免疫荧光试验观察沙门菌感染前后IPEC-J2细胞中沙门菌抗体分布水平，用超速离心法提取沙门菌感染IPEC-J2细胞上清液中的外泌体，并通过透射电镜观察外泌体形态、纳米颗粒跟踪分析测定外泌体粒径、Western blotting检测外泌体标记蛋白分子(CD9、CD63、CD81、TSG101)进行外泌体鉴定；利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测N6-甲基腺嘌呤(m6A)相关蛋白表达，同时结合转录组测序筛选上清液外泌体差异表达基因。【结果】 间接免疫荧光试验结果显示，感染组IPEC-J2细胞中可观察到大量沙门菌分布，表明沙门菌可感染IPEC-J2细胞；透射电镜和外泌体粒径分析结果显示，IPEC-J2细胞分泌的外泌体为双层膜的囊泡，直径为30～150 nm；Western blotting结果显示，C-J2细胞分泌的外泌体存在CD9、CD63、CD81和TSG101特异性标记蛋白。沙门菌感染后外泌体中m6A修饰相关基因表达检测发现，ALKBH5、YTHDC2及YTHDF1基因的mRNA和蛋白表达均显著或极显著上调(P＜0.05；P＜0.01)。转录组测序结果显示，沙门菌感染IPEC-J2细胞前后外泌体中存在1 524个差异表达基因，包括842个下调基因和682个上调基因。GO功能富集分析表明，沙门菌感染主要影响免疫系统过程、细胞连接和酶调节剂活性等生物过程；KEGG通路富集分析表明，其与IgA生产的肠道免疫网络、T细胞受体信号通路和Toll样受体信号通路等密切相关。【结论】 本研究成功分离和鉴定了沙门菌感染IPEC-J2细胞上清液中的外泌体，并且表明外泌体中m6A修饰可介导免疫信号通路来调控沙门菌感染宿主细胞，该研究可为今后深入探究外泌体对猪肠道沙门菌感染的分子机制提供理论参考。

关键词：猪;沙门菌;外泌体;小肠上皮细胞;转录组

基金资助：淮安市农业科学研究院科研发展基金(HNY202217)