携带eGFP基因的重组牛结节性皮肤病病毒的构建及其生长特性研究

来源：中国畜牧兽医杂志2024年第12期北京时间：

作者：莘若兰, 周祉玉, 张嘉雯, 杜吉革, 印春生, 王凤雪, 陈小云, 温永俊, 朱真

单位：1. 内蒙古农业大学兽医学院, 农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室, 呼和浩特 010000;2. 中国兽医药品监察所, 北京 100081

摘要：【目的】 筛选可高效率表达重组牛结节性皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus,LSDV)的不同启动子/细胞组合，据此构建携带增强绿色荧光蛋白(eGFP)基因的重组LSDV，并探究其生长特性,为后续抗病毒药物的开发以及病毒复制和作用机制的研究奠定基础。【方法】 利用融合PCR方法分别将羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)启动子、LSDV启动子与eGFP基因进行连接，用以替换LSDV 005基因，构建同源重组片段，并将其分别转染至感染LSDV的非洲绿猴肾细胞(Vero)、非洲绿猴肾细胞衍生株(Vero-E6)、牛肾细胞(MDBK)、仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)、羊睾丸细胞(LT)和原代羊睾丸细胞(PLT)6种细胞中，通过荧光显微镜观察转染效果，并使用ImageJ软件统计荧光面积百分比,筛选出最优启动子/细胞组合。以筛选出的最优组合进行重组病毒转染，并检测病毒纯化效果，进一步探究重组病毒的生长特性和稳定性。【结果】 在6种细胞中LSDV启动子的转染效果均优于ORFV启动子，且在PLT细胞中，LSDV启动子的荧光面积百分比最高(8.38%)，与其他组细胞相比差异显著(P＜0.05)。使用LSDV启动子/PLT细胞组合构建重组病毒LSDV-Δ005/eGFP，纯化后在倒置荧光显微镜下观察到所有病变部位均带有绿色荧光，荧光面积百分比约为50.8%。病毒的生长特性和稳定性分析结果显示，重组病毒LSDV-Δ005/eGFP在6种细胞中的病变效应以及病毒滴度随时间变化的趋势与野生毒株LSDV/Heilongjiang/2022相似，且在PLT细胞上连续传代10次eGFP基因稳定表达。【结论】 利用LSDV启动子/PLT细胞组合构建重组LSDV时效率最佳，据此构建的重组病毒LSDV-Δ005/eGFP生长特性与LSDV野生毒株一致，经10次传代后遗传稳定性良好。

关键词：牛结节性皮肤病病毒;细胞转染;重组病毒;生长特性

基金资助：“十四五”国家重点研究计划项目课题：草食家畜新发和重要疫病新型疫苗研究(2023YFD1802501)；国家自然科学基金地区科学基金项目(32260894)；内蒙古自治区教育厅“高校青年科技英才”项目(NJYT22043)；内蒙古农业大学青年教师科研能力提升专项(BR220113)