猪伪狂犬病病毒gB蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的建立

来源：中国畜牧兽医杂志2024年第12期北京时间：

作者：杨大为, 刘书怡, 蔺雅婷, 陈虎, 张洪亮, 李桂梅

单位：1. 青岛农业大学动物医学院, 青岛 266109;2. 山东省新兽药创制协同创新中心, 青岛 266109;3. 山东省兽药诊断试剂工程技术研究中心, 青岛 266109

摘要：【目的】 制备猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)gB蛋白单克隆抗体并建立竞争ELISA检测方法，为PRV的抗体检测及试剂盒开发提供参考。【方法】 本研究使用PRV gB蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠，使用PEG1500将小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合，用间接ELISA方法筛选出阳性杂交瘤细胞，采用有限稀释法经过2轮亚克隆，将阳性杂交瘤细胞通过体内诱生法制备腹水，并通过饱和硫酸铵法对腹水进行纯化制备单克隆抗体，用单克隆抗体建立竞争ELISA检测方法。使用棋盘法对反应条件进行优化，对阴性血清进行检测，计算该方法的临界值，并进行特异性、灵敏性和重复性试验，最后与商品化试剂盒同时对临床血清样品进行检测，比较二者的符合率。【结果】 获得2D6、2D8两株杂交瘤细胞均为IgG1型，轻链为κ链，建立的竞争ELISA方法单克隆抗体最佳稀释度为1∶400，蛋白最佳包被浓度为1 μg/mL，待检血清最佳稀释浓度为1∶4，最佳封闭液为1% BSA，酶标二抗的最佳稀释度为1∶4 000。与其他临床常见的猪病病原不发生交叉反应，具有良好的特异性。阳性血清稀释至1∶256仍为阳性，证明该方法灵敏性好。批内和批间的变异系数均＜10%，证明建立的竞争ELISA方法具有良好的重复性。与商品化试剂盒比较，总体符合率达93.3%。【结论】 本研究成功制备针对PRV gB蛋白的单克隆抗体，并应用单克隆抗体建立了PRV gB抗体竞争ELISA检测方法。

关键词：伪狂犬病病毒(PRV);gB蛋白;单克隆抗体;ELISA

基金资助：山东省重点研发计划(重大科技创新工程)项目(2023CXGC010705)；山东省生猪产业技术体系(SDAIT-08-07)