产气荚膜梭菌Alpha毒素突变体的表达及单克隆抗体制备

来源：中国畜牧兽医杂志2025年第1期北京时间：

作者：韩凤烨, 刘莹, 潘晨帆, 张乾义, 陈小云, 朱真, 印春生, 温永俊, 王凤雪, 杜吉革

单位：1. 内蒙古农业大学兽医学院, 农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室, 呼和浩特 010000;2. 中国兽医药品监察所, 北京 100081

摘要：【目的】 获得产气荚膜梭菌Alpha毒素(Clostridium perfringens alpha-toxin,CPA)的重组突变体,评价其毒力和抗原性,进而制备针对CPA的单克隆抗体,并评价单克隆抗体特性。【方法】 通过人工合成含6个氨基酸突变(第56和130位的天冬氨酸突变为甘氨酸、第275、307和331位的酪氨酸突变为苯丙氨酸、第336位的天冬氨酸突变为天冬酰胺)的CPA基因片段,并将其克隆至pET-30a(＋)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达与纯化,获得重组蛋白rCPAm6,并检测其毒力与免疫原性。将rCPAm6作为包被抗原建立CPA抗体的间接ELISA检测方法,并用灭活的天然CPA作为免疫原按照常规方法免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体,对其功能进行鉴定。【结果】 重组蛋白rCPAm6在大肠杆菌BL21(DE3)感受态中能够以可溶性和包涵体两种形式表达。毒力测定结果显示,100 μg/只rCPAm6攻毒后,小鼠全部存活。免疫原性分析结果显示,1×最小致死量(MLD)的天然CPA攻毒后,对照组小鼠全部死亡,10和20 μg/只rCPAm6免疫组小鼠存活率为100%。利用rCPAm6成功建立了CPA抗体的间接ELISA检测方法,并筛选获得4株分泌抗CPA的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为6E3、6B8、10A11、13D10,且4种细胞上清抗体效价均≥1∶3 200,其中单克隆抗体6B8细胞上清能中和天然CPA,且能与rCPAm6发生反应。【结论】 试验成功获得具有良好的安全性和免疫原性的重组蛋白rCPAm6,制备的CPA单克隆抗体6B8具有一定的中和活性及较高的特异性和敏感性。研究结果为CPA亚单位疫苗的研制提供了候选抗原,同时为CPA中毒症的治疗以及抗原/抗体检测方法的建立提供了物质基础。

关键词：产气荚膜梭菌Alpha毒素(CPA);突变体;原核表达;单克隆抗体

基金资助：国家自然科学基金地区项目(32260894);内蒙古自治区教育厅“高校青年科技英才”项目(NJYT22043);内蒙古农业大学青年教师科研能力提升专项(BR220113);“十四五”国家重点研究计划项目课题:动物疫病综合防控关键技术研究与应用(2022YFD1800704)