基于CRISPR系统的禽源多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌检测方法的建立

来源：中国畜牧兽医杂志2025年第2期北京时间：

作者：李燕红, 李鋆涛, 杨天沐, 贾梦言, 熊文广

单位：1. 广东省兽药研制与安全评价重点实验室, 广州 510642;2. 国家兽药安全评价(环境评估)实验室(华南农大), 广州 510642;3. 国家兽医微生物耐药性风险评估实验室, 广州 510642

摘要：【目的】 建立禽源多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌的可视化检测方法。【方法】 将重组酶聚合酶扩增(RPA)与成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR-Cas)系统相结合，针对两种病原菌设计特异性CRISPR相关RNA(crRNA)序列，筛选RPA引物，并对CRISPR检测体系进行优化，探究单管双靶标扩增体系，评估检测方法的特异性及灵敏度，验证临床样品检测的可行性。【结果】 本研究建立的检测方法最优组合为：Buffer中Mg2+浓度20 mmol/L、Cas12a蛋白80 nmol/L、crRNA 400 nmol/L、ROX荧光探针14 μmol/L。特异性及灵敏度检测结果显示，本研究建立的检测方法特异性良好，在蓝光下观察，灵敏度与实时荧光定量PCR一致，比普通PCR高100倍。临床样品检测结果显示，巴氏杆菌、大肠杆菌均被有效检出，本研究所建立方法的临床符合率为100%。【结论】 本研究成功建立了禽源多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌的可视化检测方法，其特异性及灵敏度较高，可以准确检测临床样品中的目标病原菌。试验结果为监测与防控禽源细菌性疾病提供了新方法。

关键词：多杀性巴氏杆菌;大肠杆菌;重组酶聚合酶扩增(RPA);CRISPR-Cas12a;可视化检测

基金资助：广东省基础与应用基础研究基金(2023A1515030137)