马山黑山羊MAPK8基因克隆、生物信息学分析及真核表达载体构建

来源：中国畜牧兽医杂志2025年第2期北京时间：

作者：雷志刚, 潘宏, 张丹丹, 刘权辉, 孙哲, 邓珊, 黄奔

单位：1. 广西大学, 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室, 南宁 530004;2. 广西医学科学院/广西壮族自治区人民医院技术支持部, 广西眼健康重点实验室, 南宁 530021

摘要：【目的】 克隆马山黑山羊丝裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8,MAPK8)基因序列，并对该基因进行生物信息学分析，构建其真核表达载体，为山羊乳腺发育及MAPK8基因在转分化过程中的研究提供试验材料。【方法】 参考山羊MAPK8基因序列(GenBank登录号：XM_018042429.1)设计引物，利用PCR扩增马山黑山羊MAPK8基因CDS序列并克隆；分别使用DNAStar和Mega 11.0软件进行序列比对及系统进化树构建，并利用ProtParam、ProtScale等软件进行生物信息学分析；构建真核表达载体并进行慢病毒包装后收集病毒液上清，感染马山黑山羊成纤维细胞，并通过实时荧光定量PCR检测感染病毒组和对照组MAPK8基因表达水平。【结果】 马山黑山羊MAPK8基因CDS区全长1 155 bp，编码384个氨基酸，蛋白分子质量为43.98 ku，分子式为C1968H3114N528O569S22，等电点(pI)为7.13。相似性比对结果显示，马山黑山羊与不同物种间MAPK8基因氨基酸序列相似性均高于85%，表明MAPK8氨基酸序列较为保守。系统进化树显示，马山黑山羊MAPK8基因氨基酸序列与牛的亲缘关系最近，与斑马鱼的亲缘关系最远。马山黑山羊MAPK8蛋白为亲水性，不属于跨膜蛋白，主要分布在细胞质(52.2%)、线粒体(26.1%)、细胞核(17.4%)和细胞膜(4.3%)中，含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域(第26―321位氨基酸处)。MAPK8蛋白二级结构包括无规则卷曲、α-螺旋、β-转角和延伸链。互作蛋白预测显示，MAPK8蛋白可能与MAPK9、JUN、TP53、FOS、JUNB、MAP2K4、MAP2K7、MAPK8IP1和NFATC3蛋白存在互作。试验成功构建MAPK8基因慢病毒真核表达载体pCDH-CMV-MAPK8-mchery-Puro，转染马山黑山羊成纤维细胞后产生红色荧光信号，试验组细胞内MAPK8基因表达量极显著高于对照组(P＜0.01)。【结论】 本研究成功克隆了马山黑山羊MAPK8基因CDS序列，并构建了pCDH-CMV-MAPK8-mchery-Puro真核表达载体，为山羊MAPK8基因功能及应用研究提供了基础数据。

关键词：马山黑山羊;MAPK8基因')">MAPK8基因;生物信息学;真核表达

基金资助：国家自然科学基金(32160171)