猪轮状病毒VP6蛋白截短表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

来源：中国畜牧兽医杂志2025年第3期北京时间：

作者：潘向英, 曾智勇, 梁海英, 汤德元, 王彬, 叶泥, 田红利, 边孟婷, 柳佳佳, 黄书

单位：贵州大学动物科学学院, 贵阳 550025

摘要：【目的】通过构建猪轮状病毒(Porcine rotavirus，PoRV) VP6截短蛋白(第177—382位氨基酸)的原核表达系统，建立检测PoRV抗体的间接ELISA方法，为PoRV血清学监测提供检测手段。【方法】设计1对针对截短VP6基因的特异性引物，以pMD19-T-VP6重组质粒为模板扩增VP6截短基因。利用pET-32a (+)原核表达载体构建pET32a-PoRV-VP6重组质粒。以大肠杆菌Rosetta (DE3)感受态细胞为宿主菌，对重组质粒进行诱导表达，并优化表达条件。利用His标签镍柱对pET32a-PoRV-VP6重组蛋白进行纯化，以此作为包被抗原，通过单一变量法优化抗原包被浓度、血清稀释度、二抗稀释度及一抗、二抗孵育时间等工作条件。确定间接ELISA方法的阴阳性临界值，检验其特异性、敏感性、重复性及符合性，并对2021—2024年采自贵州地区不同猪场的384份临床猪血清进行检测。【结果】试验成功构建pET32a-PoRV-VP6重组表达载体，实现VP6蛋白的原核截短表达，蛋白分子质量大小约40 ku，具有良好的反应原性。对间接ELISA方法条件进行优化，确定VP6包被抗原最佳浓度为2 μg/mL、阳性血清稀释度为1∶100、血清样品和二抗孵育时间均为60 min、TMB反应时间为10 min、阴阳性临界值(D450 nm)为0.410。建立的间接ELISA方法与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪冠状病毒(PDCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等病毒标准阳性血清不发生反应，特异性强；批内和批间重复试验变异系数均＜10%，重复性好；与PoRV A型ELISA抗体检测试剂盒的总体符合率为96.80%。间接ELISA方法检测临床384份猪血清样品结果显示，样品总阳性率为28.91%。【结论】本研究成功实现了PoRV VP6蛋白的截短表达，并建立了PoRV间接ELISA抗体检测方法，适用于临床PoRV抗体检测和疫苗免疫效果评价。

关键词：猪轮状病毒(PoRV);VP6蛋白;截短表达;间接ELISA

基金资助：贵州省科技支撑计划项目(黔科合支撑[2021]一般162项目)