表达猪圆环病毒2d型Cap蛋白的重组猪伪狂犬病病毒的构建

来源：中国畜牧兽医杂志2025年第5期北京时间：

作者：焦显芹, 马晓, 田润博, 刘颖, 马世杰, 陈红英

单位：河南农业大学动物医学院, 郑州 450046

摘要：【目的】利用同源重组技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术，获得表达猪圆环病毒2d型(PCV2d)Cap蛋白的重组猪伪狂犬病病毒(PRV)，为开发预防和控制PCV2d和PRV感染的疫苗提供技术支持。【方法】基于PCV2d KF1株ORF2基因序列设计1对特异引物，以PCV2d KF1株DNA为模板扩增ORF2基因。经限制性内切酶BamHⅠ酶切后将ORF2基因引入到含有绿色荧光蛋白(EGFP)基因的PRV转移载体pG中，获得重组质粒pG-PCV2d-EGFP。运用转染试剂ZLip2000将质粒pG-PCV2d-EGFP和PRV三基因缺失毒株gE-/gI-/TK- PRV NY DNA共转染至ST单层细胞中拯救重组病毒，并利用CRISPR/Cas9 EGFP基因双敲除质粒敲除重组病毒中EGFP基因。经EGFP基因测序、PCR和Western blotting对获得的重组病毒进行鉴定。【结果】经8轮绿色荧光蚀斑筛选，纯化得到重组病毒rPRV-PCV2d-EGFP。CRISPR/Cas9 EGFP基因双敲除质粒敲除EGFP基因后，经3轮筛选没有绿色荧光的蚀斑，获得重组病毒rPRV-PCV2d。EGFP基因测序结果表明，rPRV-PCV2d中EGFP基因被剪截了1 251 bp，PCR和Western blotting结果显示，rPRV-PCV2d携带的ORF2基因能在ST细胞中转录与表达。【结论】本研究成功构建表达PCV2d Cap蛋白的重组病毒rPRV-PCV2d，为进一步研制重组活载体疫苗奠定了基础。

关键词：猪圆环病毒2型;猪伪狂犬病病毒;重组病毒活载体疫苗

基金资助：河南省高校科技创新人才支持计划(21HASTIT039);河南农业大学拔尖人才项目(30501277)