稳定过表达NM-ⅡA Tail的IPEC-J2细胞系构建及其对PEDV感染的影响研究

来源：中国畜牧兽医杂志2025年第5期北京时间：

作者：黄小久, 雷磊, 彭小烨, 王开心, 陈英仪, 王济贤, 王玉格, 段德勇, 杨毅, 王爱兵

单位：湖南农业大学动物医学院, 长沙 410128

摘要：【目的】本研究利用慢病毒载体系统构建稳定过表达非肌性肌球蛋白ⅡA尾部(NM-ⅡA Tail)的猪小肠上皮细胞系(IPEC-J2)，探讨其在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染细胞过程中的作用，为揭示PEDV的感染机制提供理论依据。【方法】采用同源重组技术构建过表达pLV-CMV-NM-ⅡA Tail-3×Flag-CopGFP-Puro的重组质粒。将重组质粒与辅助质粒pMD2.G和psPAX2共转染HEK-293FT细胞，制备慢病毒液。采用慢病毒液侵染IPEC-J2细胞，经药物筛选后观察EGFP荧光标签蛋白的表达情况；利用Western blotting和实时荧光定量PCR技术鉴定过表达NM-ⅡA Tail的细胞株构建情况。结合Western blotting和免疫荧光试验(IFA)分析PEDV内化阶段的变化，通过测定病毒粒子的拷贝量和病毒滴度，分析过表达NM-ⅡA Tail对PEDV复制和释放阶段的影响。【结果】在成功构建的过表达细胞株中，NM-ⅡA Tail mRNA转录水平较对照组提高了15倍(P＜0.01)，且Western blotting验证结果显示，NM-ⅡA Tail蛋白存在高效表达。在PEDV内化阶段，过表达NM-ⅡA Tail细胞中PEDV N蛋白表达量极显著高于对照组(P＜0.01)。IFA结果显示，过表达NM-ⅡA Tail细胞中NM-ⅡA和PEDV的荧光信号强于对照组。在PEDV复制阶段，过表达NM-ⅡA Tail细胞中PEDV M基因拷贝数及病毒半数组织感染剂量(TCID50)显著或极显著高于对照组(P＜0.05；P＜0.01)。在PEDV释放阶段，过表达NM-ⅡA Tail细胞释放的PEDV M基因的拷贝数较对照组提高了2.7倍，上清中的病毒TCID50极显著高于对照组(P＜0.01)。【结论】本研究成功构建了稳定过表达NM-ⅡA Tail的IPEC-J2细胞株，为深入研究NM-ⅡA在PEDV感染过程中的作用提供了试验材料。过表达NM-ⅡA Tail显著促进了PEDV的内化、复制和释放过程，为阐明PEDV的感染机制提供了新思路，并为疫病防控策略开发提供了参考依据。

关键词：非肌性肌球蛋白ⅡA;猪流行性腹泻病毒(PEDV);慢病毒载体;过表达细胞系

基金资助：湖南省自然科学基金项目(2020JJ4041)