从江香猪睾丸生精细胞的分离培养与鉴定

来源：中国畜牧兽医杂志2025年第5期北京时间：

作者：贾雨轩, 李尧江, 曾广湖, 沈祥玉, 龚婷

单位：1. 贵州大学, 高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室, 贵阳 550025;2. 贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室, 贵阳 550025;3. 贵州大学动物科学学院, 贵阳 550025

摘要：【目的】试验旨在建立一种从江香猪睾丸生精细胞的高效体外分离和培养方法，为香猪繁殖特性研究提供材料，并为其他哺乳动物生精细胞分离培养提供技术参考。【方法】从贵州从江粤黔集团香猪原种繁殖场采集60日龄从江香猪睾丸组织，用0.25%胰酶-EDTA溶液和0.1% Ⅳ型胶原酶对其进行消化，再通过差速贴壁的方法对生精细胞进行纯化；利用间接免疫荧光染色对生精细胞进行生殖细胞特异性蛋白4(DEAD-box helicase 4，DDX4)鉴定后，再用PCR方法对3个生精细胞特异表达的标志基因DDX4、泛素羧基末端水解酶同工酶L1(ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1，UCHL-1)和Thy-1细胞表面抗原(Thy-1 cell surface antigen，THY1)进行检测，验证生精细胞。采用CCK-8细胞增殖试剂盒检测生精细胞增殖情况，并用HE染色对从江香猪的睾丸组织进行形态学验证分析。【结果】采用0.25% 胰酶-EDTA溶液+0.1% Ⅳ型胶原酶组合酶消化法+差速贴壁法，分别获得大量香猪生精细胞和支持细胞悬液。免疫荧光染色结果显示，生精细胞特异性表达的DDX4和支持细胞特异性表达的GATA结合蛋白4(GATA binding protein 4，GATA-4)的免疫阳性率均超过90%。进一步利用RT-PCR方法验证体外分离的生精细胞，特异表达DDX4、UCHL-1、THY1基因。在此基础上，建立生精细胞-支持细胞2D培养体系，将圆形或椭圆形的生精细胞附着于支持细胞上或悬浮培养基中(含10% 胎牛血清的DMEM/F12，33 ℃，5% CO2)，可稳定传至第5代。培养24 h内，生精细胞增殖效率较高，进入对数增长期；但经过72～96 h的培养后，生精细胞增殖效率减慢，培养120 h后，细胞活性开始下降，活力变差，原代生精细胞呈S型曲线增长。香猪睾丸组织HE染色验证显示，生精小管里的细胞构成与本研究所分离的生精细胞类型一致。【结论】本试验采用0.25%胰酶-EDTA溶液+0.1% Ⅳ型胶原酶的组合酶消化法对从江香猪生精细胞进行体外分离，采用差速贴壁法进行了纯化，DDX4免疫阳性率达90%以上，生精细胞特异性标志基因DDX4、UCHL-1、THY1均扩增出预期条带。分离的生精细胞采用2D培养体系，在0～24 h达到对数生长期，72～120 h进入平台期，符合生精细胞的常规生长模式和增殖规律。

关键词：从江香猪;睾丸生精细胞;分离培养;鉴定

基金资助：国家自然科学基金资助项目(32260836);贵州省科学技术基金资助项目(黔科合基础[2020]1Y135);贵州大学教学内容和课程体系改革资助项目(XJG2022028)