基于CRISPR/Cas9基因编辑系统建立WIP1基因g.37536832 C＞A位点突变的ST细胞系

来源：中国畜牧兽医杂志2025年第5期北京时间：

作者：王楠, 杜伟伟, 王婉洁, 王悦, 袁茂莎, 聂雨欣, 孙亚茹, 刘志国, 吴添文, 牟玉莲

单位：1. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193;2. 中国农业科学院农业基因组研究所, 深圳 518120;3. 新疆泰裕种猪有限公司, 五家渠 831300;4. 佛山大学生命科学与工程学院, 佛山 528225

摘要：【目的】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得野生型p53诱导磷酸酶1(wild-type p53-induced phosphatase 1，WIP1)基因与精子活力显著相关的位点g.37536832 C＞A突变的猪睾丸(swine testis，ST)细胞系，为在细胞层面上进一步探讨WIP1基因与公猪精液品质性状之间的关系奠定基础。【方法】利用CRISPOR在线网站在猪WIP1基因g.37536832 C＞A位点附近区域设计3条向导RNA(single guide RNA，sgRNA)，并将其连接至pX458-GFP载体；通过T7E1酶切试验检测3条sgRNA活性，选择效率较高的sgRNA。构建Donor载体，并将其与sgRNA载体共同转染至ST细胞，采用流式细胞术将表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的阳性细胞进行富集和单克隆细胞筛选，并对筛选出的单克隆细胞进行基因型鉴定。【结果】质粒测序结果表明，成功将3条sgRNA连接至pX458-GFP载体上；T7E1酶切结果显示，转染pX458-GFP-sgRNA1和pX458-GFP-sgRNA2质粒组产生了切割，效率分别为24%和27%，而转染pX458-GFP-sgRNA3质粒组未检测到切割，因此选择pX458-GFP-sgRNA2质粒进行试验。成功构建Donor载体，并将pX458-GFP-sgRNA2和Donor载体共转染至ST细胞。基因型鉴定结果显示，获得的269株单克隆中有205株细胞发生了基因编辑，基因编辑效率为76%，其中9株为WIP1基因g.37536832 C>A位点纯合突变的ST细胞，精确突变效率为3%。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得了WIP1基因g.37536832 C＞A位点突变的ST细胞系，为深入研究WIP1基因对公猪精液品质的影响提供了良好的细胞模型。

关键词：CRISPR/Cas9;WIP1基因')">WIP1基因;ST细胞系

基金资助：昌吉州丝绸之路经济带创新驱动发展试验区、乌昌石国家自主创新示范区科技发展计划项目(2023112311);国家自然科学基金项目(32072690)