弓形虫GRA1蛋白表达及间接ELISA检测方法的建立

来源：中国畜牧兽医杂志2025年第7期北京时间：

作者：张翩, 陈晶, 张晓晓, 麦小鹏, 唐科, 向华, 王刚, 罗胜军, 马惠海, 袁子国, 王晓虎

单位：1. 广东省农业科学院动物卫生研究所, 农业农村部禽流感等家禽重大疾病防控重点实验室, 广东省畜禽疫病防治研究重点实验室, 广东省动物疫病野外科学观测研究站, 广州 510640;2. 华南农业大学兽医学院, 广州 510642;3. 广州市正安食品有限公司, 广州 511458;4. 吉林省农业科学院(中国农业科技东北创新中心) 畜牧兽医研究所, 长春 136100

摘要：【目的】 通过原核系统表达弓形虫GRA1蛋白，并建立其抗体间接ELISA(iELISA)检测方法，为猪弓形虫抗体检测提供材料。【方法】 构建重组质粒pET-28a-GRA1，利用大肠杆菌表达系统表达GRA1蛋白，并用His镍柱进行GRA1蛋白纯化，经Western blotting鉴定其免疫原性。以纯化的GRA1蛋白作为抗原包被于固相载体，并用棋盘法确定抗原最佳包被浓度和待测血清稀释度。在此基础上，优化抗原包被条件、封闭条件、待测血清稀释度和酶标二抗稀释度。通过测定阴性血清D450 nm值确定所建立方法的临界值，并进行特异性、敏感性和重复性试验，同时测定该方法与改良凝集试验(MAT)对实际样品检测的符合率。【结果】 SDS-PAGE结果显示，GRA1蛋白以可溶性形式表达，蛋白分子质量约为25 ku。Western blotting显示GRA1蛋白与猪弓形虫阳性血清发生特异性反应。优化后的ELISA反应条件为：抗原最佳包被浓度为5 μg/mL，血清稀释度为1∶100，抗原最佳包被条件为37 ℃包被2 h，最佳封闭条件为5%脱脂奶粉37 ℃作用2 h，待检血清作用时间为60 min，酶标二抗稀释度为1∶20 000，TMB作用时间为15 min。该检测方法的临界值为0.277。该方法敏感性良好，血清按1∶6 400稀释后仍可检测到阳性；批内和批间重复性变异系数均＜10%，重复性好；与猪带绦虫、旋毛虫、猪伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清均无交叉反应，具有良好的特异性。利用该方法和MAT方法对100份临床猪血清进行检测，总符合率为94.0%。【结论】 本研究建立了一种快速有效的检测猪弓形虫抗体的间接ELISA方法，有助于猪感染弓形虫病的诊断和预防。

关键词：猪;弓形虫;GRA1;原核表达;间接ELISA

基金资助：广州市科技计划项目(2023B04J0137、2023E04J1256)；2024年乡村振兴战略专项省级组织实施项目(2024-440000-900300-0114)；南沙预制菜进出口贸易关键共性技术与标准体系制定及示范推广应用服务项目；广东省畜禽疫病防治研究重点实验室项目(2023B1212060040)