东方泰勒虫P33蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

来源：中国畜牧兽医杂志2025年第8期北京时间：

作者：王贤炅, 金钰, 夏莹, 张丙寅, 董思言, 金春梅, 于龙政

单位：延边大学农学院, 延吉 133002

摘要：【目的】 P33蛋白是东方泰勒虫(Theileria orientalis)虫体重要的表面蛋白，具有较好的反应原性和免疫原性。本试验旨在通过杂交瘤技术研制针对P33蛋白的特异性单克隆抗体，系统评估其免疫学特性并筛选出能稳定分泌该抗体的单克隆细胞株，为后续建立基于P33抗原的东方泰勒虫血清学诊断方法奠定物质基础。【方法】 通过在线软件分析预测P33蛋白信号肽位置和B细胞抗原决定簇，选择其无信号肽及有抗原优势决定簇的基因克隆至原核表达载体pET-30a(+)和pGEX-4T-1中，构建重组表达载体pET-30a-P33和pGEX-4T-1-P33，将重组质粒分别导入大肠杆菌BL21(DE3)和BL21感受态细胞进行诱导表达。使用SDS-PAGE和Western blotting分析表达产物，将过柱纯化后的pET-30a-P33重组蛋白免疫BALB/c小鼠，用pGEX-4T-1-P33重组蛋白筛选特异性单克隆抗体。利用ELISA方法进行抗体亚类鉴定和抗体效价检测；应用Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)检测单克隆抗体的反应原性和特异性。【结果】 PCR及双酶切鉴定结果显示，成功构建pET-30a-P33和pGEX-4T-1-P33 2种表达载体。SDS-PAGE 和Western blotting结果显示，成功制备了大小约 43和57 ku的pET-30a-P33和pGEX-4T-1-P33重组蛋白，并有良好的反应原性。用pGEX-4T-1-P33重组蛋白筛选，获得1株能稳定分泌 P33 蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2H10A6)。单克隆抗体亚类鉴定结果表明,2H10A6株分泌的抗体为IgG1亚类，抗体效价为1∶6 553 600。Western blotting和IFA结果显示，2H10A6杂交瘤细胞株分泌产生的抗体可与东方泰勒虫P33蛋白特异性结合。【结论】 本试验经原核表达系统成功获得了东方泰勒虫的P33重组蛋白，并成功制备了其单克隆抗体，该抗体可特异性识别P33蛋白。

关键词：东方泰勒虫;P33蛋白;原核表达;单克隆抗体

基金资助：国家自然科学基金(32060807)；吉林省教育厅“十三五”科学技术项目(JJKH20200522KJ)；高等学校学科创新引智计划(D20034)