基于CRISPR/Cas9技术的猪TRIM8基因敲除细胞系构建及其对猪流行性腹泻病毒复制的调控作用

来源：中国畜牧兽医杂志2025年第8期北京时间：

作者：王威, 毕祯彬, 顾善绅, 肖叶懿, 周雅静, 吴圣龙, 包文斌, 王海飞

单位：扬州大学动物科学与技术学院, 扬州 225009

摘要：【目的】 利用CRISPR/Cas9技术构建三方基序蛋白8(tripartite motif 8，TRIM8)基因敲除的猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)，并探究TRIM8基因敲除对猪流行性腹泻病毒(PEDV)复制的调控作用，为深入理解TRIM8基因在抗病毒天然免疫中的作用机制及开发新的PEDV防控策略提供基因资源和理论依据。【方法】 在猪TRIM8基因转录本第1外显子区域设计3条sgRNAs(sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3)，经退火形成双链DNA，与线性化pGK1.2载体连接，产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞进行鉴定。将重组载体转染IPEC-J2细胞。PCR扩增敲除位点附近序列，并通过测序判断sgRNA敲除效率；利用T7核酸内切酶Ⅰ(M0302)酶切鉴定阳性细胞克隆，通过TA克隆测序鉴定敲除序列；利用Western blotting检测基因敲除细胞中TRIM8蛋白表达情况。利用半数组织培养感染剂量(TCID50)和实时荧光定量PCR检测TRIM8基因敲除后PEDV复制的变化情况。【结果】 重组载体测序结果显示，sgRNAs与pGK1.2成功连接。敲除效率分析发现，3个sgRNAs中只有sgRNA2有敲除效率。PCR产物经T7核酸内切酶Ⅰ(M0302)酶切筛选出8个阳性单克隆细胞。TA克隆测序分析发现，TRIM8基因2个等位基因序列分别缺失5和9 bp。Western blotting结果表明，TRIM8基因敲除细胞中未见TRIM8蛋白表达。TCID50和实时荧光定量PCR检测结果显示，与野生型IPEC-J2细胞相比，敲除TRIM8基因后显著上调了PEDV的病毒滴度(P＜0.05)，且PEDV M基因和N蛋白也显著上调(P＜0.05)。【结论】 本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了TRIM8基因敲除的IPEC-J2细胞，并提高了PEDV在宿主细胞中复制的能力。TRIM8基因敲除细胞可为探究TRIM8基因功能及其调控PEDV复制的分子机制提供材料。

关键词：猪;TRIM8基因')">TRIM8基因;猪流行性腹泻病毒(PEDV);CRISPR/Cas9技术;病毒复制

基金资助：江苏省高等学校基础科学研究重大项目(22KJA230002)；江苏高校优势学科建设工程项目(PAPD)