基于鸽鹦鹉热衣原体外膜蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立及应用

来源：中国畜牧兽医杂志2025年第10期北京时间：

作者：张紫萱, 杨志远, 刘月焕, 杨宝琳, 高洁, 冯倩倩, 罗伟珏, 林健, 赵际成, 黄程, 胡格

单位：1. 北京农学院动物科学技术学院, 北京 102206;2. 北京市农林科学院畜牧兽医研究所, 北京 100097;3. 北京中海生物科技有限公司, 北京 100081

摘要：【目的】建立一种适用于鸽鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci，Cps)抗体的间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测方法。【方法】试验对Cps的主要外膜蛋白(major outer membrane protein,MOMP)编码基因进行密码子优化，在N-端加入触发因子(trigger factor，TF)后连接至pET-30a(+)载体构建重组质粒pET-30a-M，经IPTG诱导表达和纯化后，利用SDS-PAGE和Western blotting对重组蛋白进行可溶性分析及鉴定。通过棋盘滴定法选择最佳抗原包被浓度和血清稀释度，优化鸽Cps抗体的间接ELISA法。比较本研究建立的间接ELISA法与间接血凝试验(indirect hemagglutination assay,IHA)的敏感性。通过检测鸽其他常见疾病阳性血清评估该方法的特异性，检测Cps阳性和阴性血清各3份以评估其重复性，并利用253份鸽源血清(174份临床血清样品、79份Cps灭活疫苗免疫后血清样品)评估该间接ELISA法与IHA法的符合率。【结果】SDS-PAGE和Western blotting结果显示，在诱导超声破碎后上清中成功表达大小约100 ku的MOMP蛋白,表明该蛋白具有可溶性。间接ELISA法优化后条件为：2 μg/mL抗原4 ℃包被过夜，5%脱脂奶粉37 ℃封闭2 h，血清稀释度为1∶200、血清孵育时间为1 h，辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗鸽IgY孵育30 min，底物反应时间为10 min。鸽Cps阳性血清稀释度为1∶16时，间接ELISA法检测结果仍为阳性，敏感性高于IHA法。间接ELISA法与其他常见鸽病阳性血清均无交叉反应。批内和批间重复试验结果显示，间接ELISA法变异系数均＜10%，表明该方法具有良好的重复性。本研究建立的间接ELISA法和IHA法检测临床样品和免疫后血清样品的符合率分别为80.72%和85.71%，Kappa值分别为0.60和0.69。【结论】本研究建立的间接ELISA法敏感性高、特异性强、重复性好，适用于Cps血清抗体的检测。

关键词：鸽;鹦鹉热衣原体;间接ELISA;间接血凝试验(IHA);抗体

基金资助：现代农业产业技术体系北京市家禽创新团队(BAIC06-2025)；北京市农林科学院科技创新能力建设专项(KJCX20220422、KJCX20230213)