CRISPR/Cas9介导的CD71基因编辑IPI-2I细胞系的建立

来源：中国畜牧兽医杂志2025年第10期北京时间：

作者：聂雨欣, 袁茂莎, 王婉洁, 王楠, 孙亚茹, 刘志国, 牟玉莲

单位：1. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193;2. 中国农业科学院(深圳)农业基因组研究所, 深圳 518120

摘要：【目的】通过CRISPR/Cas9技术获得分化抗原71(cluster of differentiation 71，CD71)基因编辑的猪回肠上皮(immortalized porcine intestinal-2I，IPI-2I)细胞系，为进一步在细胞水平上研究CD71基因功能及其在猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)感染中的作用提供材料。【方法】针对CD71基因第3外显子及其相邻内含子区域设计5条sgRNAs，并将其连接至pX458-GFP载体；在猪胎儿成纤维(porcine embryonic fibroblast，PEF)细胞中通过T7E1酶切试验对不同sgRNA载体进行活性检测；选择切割效率较高的2个sgRNAs载体质粒分别电转染至IPI-2I细胞中，48 h后通过流式细胞仪收集带有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的单个细胞至96孔细胞培养板中扩大培养，筛选单克隆细胞；通过PCR扩增和TA克隆技术对单克隆细胞进行基因型鉴定，获得CD71基因编辑的IPI-2I细胞系。【结果】质粒测序结果表明，5条sgRNAs均成功连接至pX458-GFP载体；T7E1酶切结果显示，转染的5个sgRNAs质粒组均产生了切割，其中，pX458-sgRNA1和pX458-sgRNA4切割效率较高，分别为35.8%和44.1%。流式细胞术分选结果显示，转染pX458-sgRNA1和pX458-sgRNA4的阳性细胞比例分别为29.8%和25.7%；PCR扩增结果显示，获得的65株单克隆细胞中有14株细胞发生了基因编辑，编辑效率为22%；TA克隆结果显示，14株基因编辑细胞中有5株为单等位基因编辑，9株为双等位基因编辑。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了CD71基因编辑的IPI-2I细胞系，获得了CD71基因单等位基因编辑和双等位基因编辑细胞。试验结果为明确CD71基因功能及其介导TGEV感染的作用机制提供了良好的细胞模型。

关键词：猪;CRISPR/Cas9;CD71基因')">CD71基因;IPI-2I细胞

基金资助：农业生物育种国家科技重大专项(2023ZD04043)