伊氏锥虫ISG 65基因表达、生物信息学分析及多克隆抗体制备

来源：中国畜牧兽医杂志2025年第11期北京时间：

作者：金敏, 王美玲, 刘燕, 周娜, 赵雪晴, 党文盈, 古丽博斯坦, 阿布都卡迪尔, 巴依娜, 巴音查汗·盖力克

单位：新疆农业大学动物医学学院, 乌鲁木齐 830052

摘要：【目的】表达伊氏锥虫(Trypanosoma evansi)不变表面糖蛋白65(invariant surface glycoprotein 65,ISG 65)，分析其生物学特性及反应原性，并制备伊氏锥虫ISG 65蛋白多克隆抗体，为该类病原体检测方法的建立奠定基础。【方法】PCR扩增伊氏锥虫新疆株ISG 65基因，对测序列进行相似性比对及系统进化树构建，运用生物信息学工具对ISG 65基因编码蛋白的理化特性、亲/疏水性、跨膜区、信号肽、磷酸化位点及亚细胞定位进行预测分析。通过同源重组方法将ISG 65基因片段转染大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，经IPTG诱导表达重组ISG 65蛋白(rISG 65)，镍柱亲和层析法纯化rISG 65蛋白；利用SDS-PAGE和Western blotting验证ISG 65蛋白纯化效果。将纯化后的rISG 65蛋白免疫昆明小鼠制备多克隆抗体，采用间接ELISA方法测定多克隆抗体效价及重组蛋白反应原性。【结果】 伊氏锥虫新疆株ISG 65基因PCR扩增产物大小为657 bp，与冈比亚布氏锥虫(登录号：XM_011773430.1、XM_011773437.1)相似性最高，为99.06%，与冈比亚布氏锥虫(登录号：XM_011773430.1)亲缘关系最近并聚为一支。生物信息学分析显示，ISG 65蛋白属于亲水性蛋白，含有436个氨基酸，理论等电点为8.02。预测ISG 65蛋白存在35个磷酸化位点；二级结构中α-螺旋、无规则卷曲、β-转角、延伸链占比分别为53.21%、33.03%、2.98%和10.78%；ISG 65蛋白有14个B细胞抗原表位，具有较好的免疫原性。本试验成功构建pET-28a-ISG 65重组质粒；SDS-PAGE结果显示，重组菌pET-28a-ISG 65-BL21在37 ℃ 8 h、1.0 mmol/L IPTG中高效表达，纯化后得到的蛋白大小约24 ku。SDS-PAGE和Western blotting结果显示，均获得与预期大小一致的24 ku条带。间接ELISA检测结果显示，获得的ISG 65鼠源多克隆抗体效价为1∶1 638 400。【结论】经原核表达的重组ISG 65蛋白具有良好的免疫原性，能与伊氏锥虫阳性血清发生特异性结合反应，并具有良好的生物学特性。本研究可为后续伊氏锥虫ISG 65蛋白的生物学特性研究，以及ELISA诊断方法的建立提供重要参考数据和理论支撑。

关键词：伊氏锥虫;ISG65蛋白;原核表达;多克隆抗体

基金资助：新疆维吾尔自治区中央引导地方科技发展专项资金项目(ZYYD2023C03)