猪德尔塔冠状病毒N蛋白单克隆抗体制备及双抗体夹心ELISA方法建立

来源：中国畜牧兽医杂志2025年第11期北京时间：

作者：王田田, 于瑞明, 张莉萍, 白英杰, 张中旺, 潘丽, 张全伟, 刘新生

单位：1. 甘肃农业大学生命科学技术学院, 兰州 730070;2. 中国农业科学院兰州兽医研究所, 动物疫病防控全国重点实验室, 兰州 730046

摘要：【目的】制备猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)N蛋白的单克隆抗体并建立一种检测PDCoV抗原的双抗体夹心ELISA方法，为猪群PDCoV感染情况的临床快速、准确检测提供技术支持。【方法】通过原核表达系统表达PDCoV N蛋白并验证，用其免疫BALB/c雌鼠，利用杂交瘤细胞融合技术筛选制备抗PDCoV N蛋白的特异性单克隆抗体，并通过Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)验证单克隆抗体的反应性和特异性。将筛选到的单克隆抗体进行辣根过氧化物酶(HRP)标记，并分别与未标记的单克隆抗体两两组合配对，选择最优抗体用于双抗体夹心ELISA检测方法的建立，通过棋盘法优化捕获抗体包被浓度和酶标抗体稀释度等条件，条件优化后通过梯度稀释法确定该方法的PDCoV N蛋白和PDCoV的检出限，并验证其重复性和特异性，最终检测临床样品验证该方法与反转录实时荧光定量PCR的一致性。【结果】成功表达出纯度较高的PDCoV N蛋白，用其免疫小鼠4次后其血清抗体效价达到1∶256 000，通过杂交瘤融合技术成功筛选到6株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株(5D2-1、5D2-2、6G7-1、6G7-2、3C5和6F10)。Western blotting、IFA结果显示，筛选到的6株单克隆抗体可与PDCoV N蛋白特异性反应。配对试验结果表明，最佳捕获抗体为5D2-1，最佳检测抗体为6G7-1-HRP。本研究建立的双抗体夹心ELISA方法对PDCoV N蛋白的检出限为2 ng/mL，全病毒的检出限为7.89×103 TCID50/mL，具有良好的灵敏性。批间和批内重复试验变异系数均＜10%，且未见与其他常见猪肠道病毒发生反应，具有良好的重复性和特异性。临床样本检测结果显示，建立的双抗体夹心ELISA方法与反转录实时荧光定量PCR方法符合率为88.19%，Kappa值为0.761，表明该方法可用于PDCoV临床样品的检测。【结论】本研究成功筛选制备了6株针对PDCoV N蛋白的特异性单克隆抗体，建立了一种特异性好、灵敏度高的PDCoV双抗体夹心ELISA检测方法，为PDCoV临床诊断提供了新方法。

关键词：猪德尔塔冠状病毒(PDCoV);N蛋白;单克隆抗体;双抗体夹心ELISA

基金资助：甘肃省科技重大专项(23ZDNA007)