A型流感病毒PA蛋白纳米抗体的筛选与鉴定

来源：中国畜牧兽医杂志2025年第12期北京时间：

作者：徐洁, 申汶涛, 朱启运, 徐帅

单位：中国农业科学院兰州兽医研究所, 兰州大学动物医学与生物安全学院, 动物疫病防控全国重点实验室, 兰州 730046

摘要：【目的】构建A型流感病毒(Influenza A virus，IAV)聚合酶酸性蛋白(polymerase acidic protein,PA)的特异性纳米抗体(nanobody,Nb)噬菌体展示文库，获得广谱特异性识别PA蛋白的纳米抗体，为IAV基础研究和应用研究提供生物材料。【方法】构建真核表达IAV PA的重组质粒，使用Flag标签抗原特异抗体亲和层析法获得纯化蛋白，并以此作为免疫原与弗氏佐剂混合，对羊驼进行免疫。第5次免疫14 d后，采用间接ELISA检测羊驼血清中针对PA蛋白的抗体效价。从羊驼外周血中分离出淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL)，提取总RNA后反转录成cDNA，利用巢式PCR技术扩增重链抗体的重链可变区(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody,VHH)基因，构建pComb-VHH噬菌体重组质粒并电转化大肠杆菌SS320感受态细胞，构建纳米抗体噬菌体展示文库，同时测定该文库库容量及多样性。使用PA蛋白包被酶标板，淘选获得与PA蛋白反应的纳米抗体阳性克隆。对淘选获得的阳性克隆进行测序及真核表达，通过Western blotting、间接免疫荧光试验鉴定纳米抗体特异性。【结果】经测序验证，获得序列正确的pcDNA3.1-Flag-PA真核表达重组质粒，表达并纯化获得PA蛋白作为免疫原对羊驼进行免疫。经5次免疫后，羊驼血清中针对PA蛋白的抗体效价达到1∶64 000；成功扩增出VHH基因并构建重组率为100%、序列多样性为90%、库容量为6.5×107 CFU/mL的纳米抗体噬菌体展示文库。经过3轮富集淘选，获得6株功能区序列不同的PA蛋白纳米抗体，分别为Nb13、Nb14、Nb16、Nb20、Nb42和Nb72，其中纳米抗体Nb16可广谱特异性识别不同亚型IAV的PA蛋白。【结论】本研究成功构建 IAV PA蛋白纳米抗体噬菌体展示文库，筛选获得1株广谱特异性识别 IAV PA蛋白的纳米抗体。

关键词：A型流感病毒(IAV);聚合酶酸性蛋白;纳米抗体噬菌体展示文库;纳米抗体

基金资助：国家自然科学基金(323B2060)；兰州市科技计划项目(2024-2-15)