华西牛MSTN基因编辑细胞及胚胎的效率优化研究

来源：中国畜牧兽医杂志2026年第2期北京时间：

作者：杜志雯, 高雨馨, 刘淑琴, 马海滨, 杨磊, 宋丽爽, 白春玲, 魏著英, 李光鹏, 苏广华

单位：1.内蒙古大学生命科学学院，省部共建草原家畜生殖调控与繁育国家重点实验室，呼和浩特 0100712.内蒙古奥科斯牧业有限公司，锡林郭勒 026321

摘要：目的 对华西牛肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN）基因进行精准编辑，以提升其产肉性能，同时建立高效的基因编辑技术体系，为中国肉牛生物育种提供理论依据和技术支撑。 方法 利用CRISPR/Cas9系统设计6条靶向MSTN基因外显子1和2的sgRNAs，构建Cas9敲除载体，并通过电转法将其转染至华西牛胎儿成纤维细胞。采用流式荧光分选技术筛选突变单克隆细胞株，并通过Sanger测序验证编辑效果。利用Western blotting检测野生型及编辑后的华西牛胎儿成纤维细胞中MSTN蛋白表达水平，评估基因编辑效率。通过Cas-OFFinder软件预测脱靶位点，并在单克隆细胞株中进行测序验证。此外，以体外受精（IVF）合子为材料，使用不同的电穿孔参数，将Cas9核糖核蛋白（RNP）导入胚胎，检测卵裂率和囊胚率，并通过巢式PCR和测序验证胚胎编辑效果。 结果 试验成功构建6种Cas9敲除载体，转染效率稳定在12.7%~18.6%之间。流式荧光分选获得35株MSTN基因敲除单克隆细胞株，其中E2-3单载体和E2（2+3）双载体编辑效率最高，分别为57.9%和55.6%。Western blotting结果显示，编辑组MSTN蛋白表达量与野生型相比极显著降低（P<0.01）；脱靶检测未发现明显脱靶效应，验证了编辑系统的高特异性。在胚胎编辑试验中，优化后的电穿孔参数（25 V、6个脉冲、2.5 ms）使囊胚率达到18.7%，显著高于其他参数处理组（P<0.05）。巢式PCR和测序分析证实，编辑后的囊胚在外显子1和2中分别发生单碱基突变和多碱基突变。 结论 试验成功建立了华西牛MSTN基因编辑技术体系，实现了高效的基因敲除和胚胎编辑，为华西牛的遗传改良提供了可靠的技术方案。优化的电穿孔参数和双载体策略提升了编辑效率，且未检测到脱靶效应，为肉牛生物育种的进一步发展奠定了重要基础。

关键词：华西牛;MSTN基因')">MSTN基因;CRISPR/Cas9系统;基因编辑;胚胎电转

基金资助：肉牛内蒙古自治区“揭榜挂帅”项目(2022JBGS0018);内蒙古自治区自然科学基金-面上项目(2024MS03001);自治区科技领军人才团队项目(2022LJRC0006);内蒙古自治区重大专项(2021ZD0009)