动物源弯曲杆菌免疫显性抗原鉴定及间接ELISA检测方法的建立

来源：中国畜牧兽医杂志2026年第3期北京时间：

作者：杨欢, 王策, 王玉飞, 赵晶, 张会强, 曹易博, 姬钰浩, 邓兴梅, 张辉

单位：1.石河子大学动物科技学院，石河子 8320032.新疆生产建设兵团动物疾病防控重点实验室，石河子 832003

摘要：目的 筛选胎儿弯曲杆菌（Campylobacter fetus）、空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）血清免疫显性抗原，初步建立动物弯曲杆菌病血清学ELISA诊断方法。 方法 利用生物信息学分析软件对候选抗原进行分析筛选，用pET-28a（+）原核表达载体构建重组质粒，诱导表达并纯化重组蛋白。通过SDS-PAGE和His标签抗体Western blotting检测蛋白表达情况。制备兔源弯曲杆菌多克隆抗体并将其作为Western blotting一抗验证抗原与多克隆抗体反应原性。建立间接ELISA检测方法，优化抗原包被浓度、封闭液及封闭时间、一抗和二抗稀释度及反应时间等反应条件，确定临界值，评价其特异性、灵敏性、重复性。 结果 利用生物信息学分析软件筛选出胎儿弯曲杆菌抗原SapA、空肠弯曲杆菌抗原FlaA。原核表达纯化后，Western blotting检测SapA蛋白大小为101 ku，FlaA蛋白大小为59 ku。制备的胎儿弯曲杆菌兔多克隆抗体血清效价为1∶64 000，空肠弯曲杆菌兔多克隆抗体效价为1∶128 000。Western blotting结果表明，抗原SapA、FlaA特异性识别弯曲杆菌多克隆抗体，具有良好的反应原性。以纯化的SapA蛋白作为包被抗原，确定的最优包被浓度为2.5 μg/mL，封闭液为5% BSA，封闭时间30 min，一抗、二抗稀释度分别为1∶500和1∶8 000，孵育时间分别为30和90 min。以纯化的FlaA蛋白作为包被抗原，确定最优包被浓度为0.4 μg/mL，封闭时间1 h，其余条件与前者一致。二者与结核分枝杆菌（MTB）、副结核分枝杆菌（MAP）及布鲁氏菌（Brucella）均无交叉反应，特异性强。SapA间接ELISA方法的灵敏性最低达到1∶6 400，FlaA间接ELISA方法的灵敏性达到1∶12 800。批内和批间重复性试验变异系数均<10%，证明其重复性好。 结论 本研究成功鉴定了胎儿弯曲杆菌免疫显性抗原SapA、空肠弯曲杆菌免疫显性抗原FlaA，建立了动物弯曲杆菌病血清学间接ELISA诊断方法，为弯曲杆菌病防控提供了有效的诊断抗原及快速诊断方法。

关键词：弯曲杆菌;免疫显性抗原;原核表达;Westernblotting;间接ELISA

基金资助：新疆生产建设兵团重点领域科技攻关项目(2024AB034);新疆生产建设兵团重点领域科技攻关项目(2024AB035);新疆生产建设兵团重点领域科技攻关项目(2025AB083);新疆维吾尔自治区“天池英才”引进计划;石河子大学国际科技合作推进计划项目(GJHZ202402)