ATG16基因缺陷Vero细胞系的建立及其抗小反刍兽疫病毒功能分析

来源：中国畜牧兽医杂志2026年第4期北京时间：

作者：赵庆露, 陈红梅, 韦定呈, 朱学亮, 王炫杰, 胡占颖, 李瑞哲, 张瑞

单位：1.西南民族大学，动物医学四川省高等学校重点实验室，成都 6100412.中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，兰州 730046

摘要：目的 利用CRISPR/Cas9技术构建自噬相关基因ATG16敲除的Vero细胞，并探究ATG16基因敲除对小反刍兽疫病毒（PPRV）复制的影响，为深入了解ATG16在抗病毒天然免疫中的作用机制及开发新的PPRV防控策略提供基因资源和理论依据。 方法 使用在线工具（红棉系统）设计ATG16基因gRNAs。将gRNA克隆到CRISPR-UTM表达载体，构建ATG16基因敲除载体。采用电转法将ATG16基因敲除载体转入Vero细胞。使用5 μg/mL嘌呤霉素筛选阳性克隆。通过靶位点扩增及测序验证筛选出成功敲除ATG16基因的阳性克隆。通过Western blotting检测基因敲除细胞中ATG16的表达情况。利用半数组织培养感染剂量（TCID50）、实时荧光定量PCR及Western blotting检测ATG16基因敲除后PPRV复制的变化情况。利用Western blotting检测敲除ATG16基因对细胞自噬的影响。 结果 PCR结果显示，筛选的阳性克隆靶位点无扩增片段。测序结果显示，靶标区域被删除61 bp，表明成功构建ATG16基因敲除的Vero细胞株。Western blotting结果表明，与野生型Vero细胞相比，敲除细胞中没有ATG16蛋白表达。Western blotting、TCID50和实时荧光定量PCR结果显示，与野生型Vero细胞相比，ATG16基因敲除细胞中PPRV N基因相对表达水平显著下调（P<0.05），PPRV N蛋白表达被抑制，PPRV滴度显著降低（P<0.05）。Western blotting结果显示，PPRV感染ATG16敲除细胞不能诱导微管相关蛋白1轻链3（LC3）-Ⅱ（LC3-Ⅱ）的形成。 结论 本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了ATG16基因敲除的Vero细胞，并发现敲除ATG16基因可抑制PPRV在Vero细胞中复制和诱导细胞自噬的能力，为深入探索ATG16调控PPRV复制的分子机制奠定了基础。

关键词：ATG16基因')">ATG16基因;小反刍兽疫病毒（PPRV）;Vero细胞;病毒复制;自噬

基金资助：国家自然科学基金项目(32302870);四川省青年基金项目(2025ZNSFSC1071);西南民族大学引进人才科研启动金资助项目(RQD2023034)