鸭坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅲ抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

来源：中国畜牧兽医杂志2026年第4期北京时间：

作者：曲哲会, 张孟云, 陈晶晶, 聂雅诺, 王凤瑞, 刘志科, 焦凤超, 郝香琪, 梁成成, 郭晓秋

单位：1.信阳农林学院动物科技学院，信阳 4640002.河南省水禽资源开发利用与疫病防控工程技术研究中心，信阳 4640003.信阳市畜禽重大疫病防控综合技术研究重点实验室，信阳 464000

摘要：目的 建立鸭坦布苏病毒（DTMUV）E蛋白结构域Ⅲ（E-DⅢ）抗体间接ELISA检测方法，为DTMUV血清学监测提供一种检测手段。 方法 利用PCR扩增DTMUV E-DⅢ基因，连接至pET-30a（+）载体构建重组质粒pET-E-DⅢ，转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞，经IPTG诱导后，SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达产物，建立E-DⅢ蛋白抗体间接ELISA检测方法，优化抗原浓度和抗体稀释度、封闭条件、待检血清反应条件、酶标二抗反应条件和显色时间，明确临界值判断标准，评价所建立抗体间接ELISA检测方法的特异性、敏感性和重复性，并对背景清楚的126份血清进行检测。 结果 成功构建含大小约300 bp目的条带的重组质粒pET-E-DⅢ，诱导表达获得分子质量约16 ku的重组蛋白E-DⅢ，且以可溶性和包涵体共存表达，浓度为284.5 mg/L。经筛选确定最佳间接ELISA工作条件为：E-DⅢ蛋白包被浓度为250 ng/mL，待检血清稀释度为1∶80，封闭条件为25 ℃封闭1.5 h，待检血清反应条件为37 ℃孵育1 h，酶标二抗为1∶7 500稀释，37 ℃孵育1 h，显色时间为10 min。确定D450 nm值≥0.337为阳性，D450 nm值≤0.282为阴性。特异性试验结果显示，该方法仅DTMUV阳性血清检测结果为阳性，新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒1型和3型阳性血清检测结果均为阴性。敏感性试验结果显示，该方法检测阳性血清的最大稀释度为1∶1 280。重复性试验结果显示，批内试验和批间试验变异系数分别为2.11%~5.09%和3.25%~6.95%。126份背景清楚血清检测结果显示，阳性和阴性血清符合率分别为95.83%和96.30%。 结论 本研究表达纯化了DTMUV E-DⅢ蛋白，并成功建立了基于E-DⅢ蛋白的特异性好、敏感性高、重复性良好的抗体间接ELISA检测方法。

关键词：鸭坦布苏病毒（DTMUV）;E蛋白结构域Ⅲ;原核表达;间接ELISA;抗体

基金资助：河南省科技攻关项目(242102110075);河南省科技攻关项目(252102110009);河南省高等学校重点科研项目(24B230007);信阳农林学院动物科技学院大学生创新训练项目(URPDY202504)