BLG基因敲除通过PI3K/Akt信号通路调控牛乳腺上皮细胞增殖

来源：中国畜牧兽医杂志2026年第6期北京时间：

作者：史倩倩, 曹振, 赵芳, 刘萍, 陈坤琳, 仲跻峰, 林志平, 高运东, 王慧利, 杨凌, 丁强

单位：1.河北工程大学生命科学与食品工程学院，邯郸 0560382.江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏省畜禽精准育种工程研究中心，农业农村部种养结合重点实验室，南京 2100143.江苏优源奶业产业研究院有限公司，南京 2111004.山东奥克斯畜牧种业有限公司，济南 250100

摘要：目的 β-乳球蛋白（BLG）作为牛奶中的主要过敏原，主要由牛乳腺上皮细胞（bMECs）合成并分泌，受BLG基因调控表达。本研究拟探讨BLG基因敲除对bMECs增殖的影响及其潜在分子机制。 方法 将CRISPR/Cas9质粒与靶向BLG基因的sgRNA质粒通过电转染导入bMECs，结合嘌呤霉素和荧光进行筛选，并通过PCR扩增与测序鉴定单克隆细胞株编辑类型，获得BLG基因敲除（BLG-KO）细胞模型；利用流式细胞术分析细胞周期分布，并通过CCK-8法与EdU染色检测细胞生长与增殖活性；采用转录组测序筛选与细胞增殖相关的信号通路；运用Western blotting检测BLG基因敲除后增殖相关蛋白的表达水平；通过LY294002抑制PI3K表达，并通过CCK-8法检测细胞增殖活力变化。 结果 共获得35株BLG基因敲除单克隆细胞株，其中10株为双链纯合编辑。Western blotting结果显示，与WT组相比，BLG-KO细胞中BLG蛋白表达水平极显著降低（P<0.01）。流式细胞术结果表明，与WT组相比，BLG-KO组G0/G1期细胞比例极显著下降（P<0.01），S与G2/M期细胞比例极显著增加（P<0.01）。EdU与CCK-8检测结果显示，与WT组相比，BLG-KO组处于增殖状态的细胞比例极显著升高（P<0.01），细胞生长速度极显著加快（P<0.01），且增殖相关蛋白（PTEN、PCNA）表达水平极显著升高（P<0.01）。转录组测序发现，BLG-KO与WT组的差异表达基因主要富集于PI3K/Akt信号通路。Western blotting验证显示，BLG-KO组细胞中PI3K、AKT蛋白表达水平极显著高于WT组（P<0.01），且PI3K、AKT蛋白磷酸化水平较WT组也有所升高；同时，与WT组相比，WT+LY294002组PI3K蛋白及其磷酸化表达水平显著降低（P<0.05），AKT蛋白表达水平极显著降低（P<0.01）；与BLG-KO组相比，BLG-KO+LY294002组PI3K、AKT蛋白及其磷酸化表达水平极显著或显著降低（P<0.01；P<0.05）。CCK-8检测结果显示，48 h时WT+LY294002组细胞活力极显著低于WT组（P<0.01）；且BLG-KO+LY294002组细胞活力极显著低于BLG-KO组（P<0.01）。 结论 本研究成功构建BLG基因敲除的bMECs模型，并揭示了BLG基因缺失通过激活PI3K/Akt信号通路促进细胞增殖。

关键词：BLG基因')">BLG基因;牛乳腺上皮细胞;基因敲除;增殖;PI3K/Akt通路

基金资助：国家自然科学基金(32472872);江苏省重点研发计划(BE2021372);江苏省自然科学基金(BK20221433)