人类细胞外囊泡的产量优化与应用*

来源：中国生物工程杂志2024年第9期北京时间：

作者：王晨蕾, 程临钊, 刘森泉

单位：中国科学技术大学生命科学与医学部 合肥 230027

摘要：目的: 构建与优化细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)的高产平台,验证此平台是否适用于功能蛋白的装载与递送。方法: 通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、流式细胞术或Western blot(WB)检测细胞目的基因表达,采用差速超速离心法浓缩EVs,分别利用WB与纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis, NTA)检测EVs标记蛋白表达、粒径分布与产量。利用脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)诱导的A549细胞损伤模型验证EVs递送功能蛋白的能力。通过CCK8检测细胞活力,通过Annexin V检测细胞凋亡,利用qRT-PCR检测Wnt/β-catenin下游基因AXIN2、TCF4、NKD1的表达。结果: 流式细胞术结果表明CD9、CD81均能在HEK293T和HEK293F上过表达,NTA检测显示CD9更有助于EVs产量的提高。实现在贴壁细胞体系中EVs产量提升4倍,在悬浮细胞体系中EVs产量提升6倍。之后验证高产平台是否适用于功能蛋白Wnt3a的装载与递送。WB结果证实此高产平台能装载Wnt3a蛋白,NTA检测表明此高产平台在装载Wnt3a的同时将EVs产量提升3倍左右。CCK8、Annexin V结果显示CD9 Wnt3a EVs能明显提高A549细胞在LPS诱导损伤后的细胞活力,抑制细胞凋亡。机制上,qRT-PCR表明CD9 Wnt3a EVs激活了Wnt/β-catenin下游基因AXIN2、TCF4、NKD1的表达。结论: 构建了一种基于CD9过表达的EVs高产平台,该平台对EVs产量的提升在贴壁细胞与悬浮细胞中均得到了验证,该平台对功能蛋白Wnt3a的递送能力在LPS诱导的A549细胞损伤模型中得到了验证。该平台为实现EVs量产提供了新策略,有望成为一种新的功能蛋白递送平台,在生物学研究和无细胞治疗领域开拓更多应用。

关键词：细胞外囊泡,CD9,CD81,Wnt3a

基金资助：* 国家自然科学基金(82250710171)","国家自然科学基金(82100243)