单细胞PCR体系的建立及其在CRISPR/Cas9靶点活性检测中的应用

来源：中国生物工程杂志2017年第2期北京时间：

作者：徐振宇, 任红艳, 毕延震, 郑新民, 李莉, 张佳兰

单位：1. 长江大学动物科学学院 荆州 434025;2. 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 动物胚胎工程与分子育种湖北省重点实验室 武汉 430064

摘要：单细胞PCR是以单个细胞所含的DNA或RNA为模板进行扩增，因此其模板的制备是影响整个反应成功与否的关键因素。利用三种不同蛋白酶K细胞裂解液（SDS细胞裂解液、NP-40细胞裂解液、Tween-20细胞裂解液）分别对体外培养成熟的单个猪卵母细胞进行裂解，并直接作为模板进行PCR扩增，结果表明：NP-40细胞裂解液制备的模板质量最好，其扩增效率为95%；其次为Tween-20细胞裂解液，其扩增效率为65%；SDS细胞裂解液产物中未检测到阳性条带。结合显微注射技术对sgRNA靶点活性进行检测，结果表明利用单细胞PCR结合显微注射的方法，在受精卵内对CRISPR/Cas9靶点活性进行检测确实可行，检测结果真实可靠。

关键词：基因修饰动物,单细胞PCR,细胞裂解液,靶点活性检测

基金资助：转基因生物新品种培育重大专项（2016ZX08006001-005，2016ZX08006002-006，2016ZX08010003-006）、湖北省农业科技创新中心（2016-620-000-001-027）、湖北省科技支撑计划（2014BBB010）资助项目