一种用于提高基因打靶效率的双荧光筛选策略

来源：中国生物工程杂志2017年第1期北京时间：

作者：陈建武, 任红艳, 华文君, 刘西梅, 綦世金, 周黎, 欧阳艳, 毕延震, 杨烨, 郑新民

单位：1. 长江大学动物科学学院 荆州 434025;2. 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室 武汉 430064;3. 湖北三峡职业技术学院农学院 宜昌 443000

摘要：同源重组介导的基因打靶技术因其准确性高、引入的突变可以预测，已经成为功能基因组研究的重要工具。但是在真核生物体内，天然同源重组的概率极低，对后续的筛选和鉴别造成很大困扰。因此，建立一个广谱性的高效筛选策略极为重要。研究基于“双荧光”的可视化筛选，通过提高筛选效率，从而建立了一种显著提高同源重组打靶效率的新策略。该策略以绿色荧光蛋白基因和新霉素基因为正筛选标记，以红色荧光蛋白基因为负筛选标记。经过G418筛选后，挑取仅表达绿色荧光蛋白的抗性克隆，用于跨界PCR检测。研究尝试运用上述新策略，借助CRISPR/Cas9技术，对猪肌抑素基因进行同源重组介导的基因打靶。在选取的T1和T2两个靶位点处，“双荧光”策略筛选的细胞阳性率分别达到80.5%和86.7%，筛选效率得到显著提高。研究建立的“双荧光”可视化筛选策略具有高效性和广谱性，在动物基因编辑领域具有广阔的应用前景。

关键词：基因打靶,CRISPR/Cas9,同源重组,肌抑素

基金资助：转基因生物新品种培育科技重大专项（2016ZX08006001-005，2016ZX08006002-006，2016ZX08010003-006），湖北省科技支撑计划（2014BBB010），湖北省农业科技创新中心（2016-620-000-001-027）资助项目