Pichia pastoris X-33 ΔGT2缓解甘油对AOX1的阻遏并用于外源蛋白的高效表达

来源：中国生物工程杂志2017年第1期北京时间：

作者：张震阳, 杨艳坤, 战春君, 李翔, 刘秀霞, 白仲虎

单位：1. 江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室 无锡 214122;2. 江南大学 工业生物技术教育部重点实验室 无锡 214122;3. 江南大学 糖化学与生物技术教育部重点实验室 无锡 214122

摘要：巴斯德毕赤酵母是甲醇酵母，作为应用最广泛的真核表达系统之一，在以甲醇为唯一碳源时可以利用醇氧化酶启动子PAOX1进行外源蛋白的表达，但是这一过程会被甘油阻遏。近几年有研究表明，甘油转运体不仅有运输甘油的功能，还与甘油、甲醇的代谢有一定的联系。目的：构建了甘油转运体GT2（PAS_chr3_1076）缺失菌株P. pastoris X-33 ΔGT2，研究该菌株的甘油去阻遏效应和在不同碳源培养基中诱导PAOX1启动子驱动外源蛋白的表达水平。方法：构建以甲醇诱导型启动子PAOX1调控外源基因EGFP的表达载体PAOX1-EGFP，经酶线性化后电转野生型菌株P. pastoris X-33获得重组菌株x-EGFP；通过同源重组的方法敲除GT2基因，获得ΔGT2-EGFP敲除菌株；以ΔGT2-EGFP和X-EGFP为出发菌株，在甘油、甲醇，以及甘油甲醇混合为碳源诱导醇氧化酶AOX1及绿色荧光蛋白EGFP的表达和生长情况，并检测在以甘油为唯一碳源时，胞外的甘油含量。结果：在以甘油甲醇混合碳源培养时，突变体ΔGT2-EGFP菌株中AOX1单位酶活比野生型菌株高出近35%，单位荧光强度要高出近70%；在以甘油为唯一碳源时，X-EGFP最终收获时的生物量比ΔGT2-EGFP多，且发酵液中甘油含量相对较少；以混合碳源培养时ΔGT2总外源蛋白表达水平最高。结论：实验表明，GT2参与甘油的吸收与代谢，ΔGT2突变株可在一定程度上解除甘油对甲醇的代谢抑制，暗示甘油转运体与PAOX1相关，且基于此研究结果有望优化出更高效的酵母表达系统。

关键词：巴斯德毕赤酵母,甘油转运体,GT2,甘油阻遏,基因敲除

基金资助：国家自然科学基金（31570034），江苏省自然科学基金（BK20150148），中央高校基本科研业务费专项（JUSRP51401A）资助项目