高山被孢霉亚甲基四氢叶酸脱氢酶的克隆、表达和功能鉴定

来源：中国生物工程杂志2016年第11期北京时间：

作者：王鸿超, 张陈, 陈殿宁, 乔菊园, 陈海琴, 顾震南, 张灏, 陈卫, 陈永泉

单位：江南大学食品学院 无锡 214122

摘要：叶酸代谢途径中的亚甲基四氢叶酸脱氢酶（MTHFD）可将5，10-亚甲基四氢叶酸氧化为5，10-甲炔基四氢叶酸，此过程会生成NADH或NADPH。对高山被孢霉中的MTHFD基因进行克隆、表达和功能鉴定，可进一步阐明脂质合成所需还原力NADPH的来源。首先对MTHFD序列进行分析，并以pET28a（+）质粒为载体构建了MTHFD的表达载体，然后转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达。进一步利用Ni金属螯合层析纯化目的蛋白，采用比色法分析酶反应产物，表明纯化蛋白质具有MTHFD活性。高山被孢霉MTHFD对NAD和NADP均具有催化能力，但更偏好于将NADP转化为NADPH。最后对高山被孢霉进行发酵培养，发现MTHFD的转录水平在脂质开始积累后发生了明显的上调，表明MTHFD在高山被孢霉脂质合成过程中发挥重要作用，很可能是脂质合成所需NADPH的关键来源。这为对高山被孢霉进行分子改造，使之成为高产各种多不饱和脂肪酸的细胞工程提供了理论依据。

关键词：功能鉴定,亚甲基四氢叶酸脱氢酶,NADPH,脂质合成,高山被孢霉

基金资助：国家自然科学基金青年科学基金资助项目（31400038）