细粒棘球蚴EgG1Y162基因进化分析、表达及鉴定

来源：中国生物工程杂志2016年第4期北京时间：

作者：祖力皮也·吐尔逊, 曹春宝, 温浩, 丁剑冰, 德力夏提·依米提

单位：1. 新疆重大疾病医学实验室-省部共建国家重点实验室培育基地 新疆医科大学第一附属医院 乌鲁木齐 830054;2. 新疆医科大学科研处 乌鲁木齐 830011

摘要：目的:克隆和鉴定细粒棘球蚴的EgG1Y162基因,分析其蛋白表达和适应性进化并鉴定抗原性。方法: 根据emY162基因序列设计引物,分别从细粒棘球绦虫原头蚴、囊壁生发层、成虫和虫卵四个发育阶段,提取基因组DNA和总RNA,mRNA反转录为cDNA,利用PCR的方法以基因组DNA和cDNA为模板扩增EgG1Y162基因;构建PUCm-T/EgG1Y162重组质粒,经PCR、酶切及测序鉴定后,测序确定其正确性。利用DNAman软件与MEGA4软件对EgG1Y162基因特点进行分析并构建EgG1Y162核酸序列的进化树进一步探讨其同源性。荧光定量PCR检测EgG1Y162 基因在细粒棘球绦虫原头蚴、囊壁生发层、成虫和虫卵四个不同发育阶段的表达情况。利用定向克隆技术将EgG1Y162抗原基因片段克隆至原核表达质粒PET-41a上,通过酶切分析和PCR 鉴定筛选出阳性克隆,测序确定序列。IPTG初步诱导和表达EgG1Y162-GST 重组蛋白,通过SDS-PAGE电泳和Western blot试验分析鉴定。 结果: 从细粒棘球绦虫的两个不同发育阶段均克隆出EgG1Y162基因,从总DNA克隆得到片段长度1 680bp,从cDNA克隆得到片段长度459bp。相似性比较表明,EgG1Y162基因序列与emY162相似性为91%,而EgG1Y162基因cDNA与emY162相似性为95%。进一步分析显示,EgG1Y162基因序列由3个外显子和2个内含子组成,外显子区域分别为1~70,1 064~1 380和1 577~1 648。位于疏水端1~16位氨基酸构成EgG1Y162信号肽序列,35~115位氨基酸形成一个大的纤黏连蛋白剪接体FN3,133~152位氨基酸构成羧基端跨膜区域。测序结果显示EgG1Y162抗原基因长度为360bp,编码120个氨基酸。通过荧光定量PCR检测,发现EgG1Y162在成虫、生发层阶段、原头蚴和虫卵阶段均有不同程度的表达。但是EgG1Y162在成虫中的表达量最多,相对值为19.526,差异有统计学意义(P<0.01),其次生发层阶段,为5.122,再次在原头蚴阶段,相对值为5.083,而在虫卵阶段最少,为1.6588。构建的PET-41a/EgG1Y162原核表达质粒,经IPTG诱导后,SDS-PAGE 检测表明EgG1Y162-GST重组蛋白得到成功表达,在相对分子量为44kDa 处有表达条带。Western blot 分析显示阳性印迹条带,分子量为44kDa,EgG1Y162重组蛋白能与细粒棘球蚴感染40天后犬的血清发生反应;与包虫病患者血清也有阳性反应。结论: 成功克隆EgG1Y162抗原基因,序列对比分析显示EgG1Y162的cDNA与emY162的cDNA具有很高的相似性,基因的差异性主要存在于内含子区域,EgG1Y162抗原基因是一种新的基因。EgG1Y162在成虫中的表达量最多。成功诱导表达出EgG1Y162重组蛋白,并且EgG1Y162重组蛋白具有很好的抗原性。

关键词：EgG1Y162抗原,进化树,荧光定量PCR,原核表达

基金资助：国家自然科学基金(31000411,81160378)资助项目