基于定点突变技术对苦荞麦胰蛋白酶抑制剂活性位点的研究

来源：中国生物工程杂志2015年第12期北京时间：

作者：阮景军, 杨毅, 唐自钟, 陈惠

单位：1. 四川农业大学 生命科学学院 雅安 625014;2. 武汉生物工程学院 生物科学与技术学院 武汉 430415

摘要：目的:为了研究胰蛋白酶抑制剂的活性位点,揭示FtTI结构与功能的关系。将FtTI和突变体aFtTI-R65L,aFtTI-D67V和aFtTI-R65L/D67V经IPTG诱导培养5h,收集菌液经过超声波破碎得到粗产物,经过纯化后的胰蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶的摩尔抑制比分别为1:1,1:1.15,1:1.3,1:1.2;抑制常数Ki分别为1.62nM,1.69 nM,1.9 nM,1.8 nM (BApNA作为底物)。结果:SDS-PAGE分析表明突变前和突变后表达产物胰蛋白酶抑制剂的大小一致,均为9.5 kDa。对突变体aFtTI-R65L,aFtTI-D67V和aFtTI-R65L/D67V抑制反应温度研究表明,其最适反应温度均为40℃。在10~80℃保温30 min后,突变体对胰蛋白酶的抑制活性仍保留80%以上;在90℃保温30 min,突变体的抑制活性开始显著下降,只保留其39%。具有较高的耐热性。将aFtTI在pH 3.0~10.0的不同缓冲溶液中放置30 min后,其抑制活性可保留90%左右,在pH 2.0条件下,aFtTI抑制活性丧失约31%;在pH 11.0条件下,aFtTI抑制活性丧失约43%。结论:对苦荞麦蛋白酶抑制剂FtTI的定点突变并不会改变它是一种偏碱性的胰蛋白酶抑制剂的性质,突变前后均保持了耐碱性的特点。

关键词：苦荞麦,胰蛋白酶抑制剂,定点突变,表达,抑制活性

基金资助：四川省科技厅国际合作项目(2010hh0040)资助项目