扬州大学学报·农业与生命科学版杂志投稿格式参考范文：通过自诱导体系在工程菌中合成山奈酚的研究

　　类黄酮是一大类植物次生代谢产物，具有多种有益健康的生物活性，山奈酚(KMF)作为重要的黄酮醇化合物，具有抗氧化、抗癌、抗菌和抗炎等广泛的药物和生物学特性，在医药和食品工业中应用潜力巨大。目前，KMF 主要通过传统植物组织有机溶剂提取或化学合成获得，但前者因植物中 KMF 含量低导致耗时、繁琐、成本高，后者需多步骤、有毒试剂和极端条件，经济和安全性不足，均限制了大规模生产。

　　随着合成生物学发展，生物合成途径成为新策略。KMF 生物合成中，黄烷酮 3 - 羟化酶(F3H)和黄酮醇合酶 1(FLS1)是关键酶，可催化柚皮素(NRN)转化为 KMF。已有研究利用工程菌实现 KMF 合成，但存在操作复杂、耗时费力等问题。因此，本研究旨在利用自诱导培养基优化工程菌合成 KMF 的过程，提高产量和效率。

　　1 材料与方法

　　1.1 细菌菌株、质粒、试剂和 AIM

　　菌株与培养：大肠埃希菌 DH5α 和 BL21 (DE3) 用含 34 μg・mL⁻¹ 氯霉素的 LB 培养基培养。

　　质粒与酶：原核表达载体 pACYCDuet-1 用于克隆目的基因，限制性内切酶、T4 DNA 连接酶等购自相应公司。

　　试剂与培养基：标准品 NRN、DHK、KMF 及化学品购自 Sigma-Aldrich 公司。初始自诱导培养基(AIM)含胰蛋白胨、酵母提取物、(NH₄)₂SO₄、KH₂PO₄、Na₂HPO₄、葡萄糖、乳糖和 MgSO₄等成分。

　　1.2 重组质粒构建

　　通过 PCR 扩增拟南芥来源的 AtFLS1 和 AtF3H 基因，克隆至 pACYCDuet-1 载体中，构建重组质粒 pACYCDuet-AtFLS1-AtF3H，其中 AtFLS1 插入 SalI 和 NcoI 位点，AtF3H 插入 NdeI 和 XhoI 位点。

　　1.3 工程菌中 KMF 的初始自诱导体系建立

　　将重组质粒转化至大肠埃希菌 BL21 (DE3)，接种至含氯霉素和 0.5 mmol・L⁻¹ NRN 的初始 AIM 中，25℃振荡培养 24 h，用乙酸乙酯提取类黄酮，甲醇溶解后进行 HPLC/ESI-MS 分析。

　　1.4 HPLC/ESI-MS 分析

　　将样品用 50% 乙腈稀释过滤后，按实验室方法进行 HPLC/ESI-MS 分析，检测类黄酮成分。

　　1.5 AIM 优化

　　乳糖浓度优化：在含 0.5 g・L⁻¹ 葡萄糖和 0.5 mmol・L⁻¹ NRN 的 AIM 中，设置乳糖浓度为 1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0 g・L⁻¹，筛选最佳浓度。

　　葡萄糖浓度优化：在含 4.0 g・L⁻¹ 乳糖和 0.5 mmol・L⁻¹ NRN 的 AIM 中，设置葡萄糖浓度为 0、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 g・L⁻¹，筛选最佳浓度。

　　1.6 培养条件优化

　　温度优化：在 25、35、45℃下培养工程菌，确定最佳反应温度。

　　底物浓度优化：在含 0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mmol・L⁻¹ NRN 的 AIM 中，35℃培养 24 h，优化底物浓度。

　　反应时间优化：在含 2.0 mmol・L⁻¹ NRN 的 AIM 中，35℃分别培养 12、24、36、48 h，确定最佳反应时间。

　　1.7 统计分析

　　试验结果以 “均值 ± 标准差” 表示，采用双尾学生 t 检验评估组间差异显著性，P<0.05 为显著，P<0.01 为极显著。

　　2 结果与分析

　　2.1 工程化大肠埃希菌 BL21 (DE3) 中 KMF 的初始自诱导体系建立

　　构建的重组质粒 pACYCDuet-AtFLS1-AtF3H 转化至大肠埃希菌 BL21 (DE3) 后，在初始 AIM 中培养，HPLC/ESI-MS 分析显示，培养物中产生保留时间为 10.37 min(m/z 285.1000，KMF)和 6.59 min(m/z 287.1000，DHK)的化合物，证实自诱导体系成功合成 KMF。

　　2.2 AIM 成分优化

　　乳糖浓度：KMF 产量随乳糖浓度升高至 4.0 g・L⁻¹ 时达平台期，确定最佳乳糖浓度为 4.0 g・L⁻¹。

　　葡萄糖浓度：KMF 产量随葡萄糖浓度升高至 0.5 g・L⁻¹ 后下降，最佳葡萄糖浓度为 0.5 g・L⁻¹。

　　2.3 培养温度优化

　　在 25、35、45℃下培养，KMF 产量在 35℃时达峰值，确定最佳培养温度为 35℃。

　　2.4 底物浓度优化

　　随 NRN 浓度增加至 2.0 mmol・L⁻¹ 时，KMF 产量达平台期，底物转化率随浓度升高而降低，最佳底物浓度为 2.0 mmol・L⁻¹。

　　2.5 反应时间优化

　　反应时间延长至 24 h 时，KMF 产量达平台期，底物转化率持续增加后趋缓，最佳反应时间为 24 h。

　　2.6 优化前后 KMF 产量对比

　　优化后 KMF 产量从(97.89±3.64)mg・L⁻¹ 提高至(212.46±3.22)mg・L⁻¹，为优化前的 2.17 倍;底物转化率从(66.15±1.16)% 提高至(85.87±0.49)%，显著提升合成效率。

　　3 讨论

　　本研究通过优化自诱导培养基(AIM)的葡萄糖、乳糖浓度及培养温度、底物浓度、反应时间等参数，显著提高了 KMF 产量和底物转化率。AIM 中葡萄糖和乳糖的代谢顺序影响基因表达，高浓度葡萄糖因碳分解代谢物阻遏效应抑制 KMF 合成，而优化后的乳糖浓度可有效诱导靶蛋白表达。与传统 IPTG 诱导方法相比，自诱导体系无需监测细胞密度和添加诱导剂，操作简便、成本低、适合工业化放大生产。

　　研究也指出未来优化方向，如筛选不同来源的 F3H 和 FLS1 酶、优化密码子、固定化工程菌、选育高产菌株或采用补料分批培养等，以进一步提升 KMF 产量和降低成本。

陈 磊;张智萍;廖 凯;张新跃,扬州大学生物科学与技术学院,202405