猪细小病毒检测ICC-qPCR替代方法的建立*

来源：药物分析杂志2021年第1期北京时间：

作者：张羽, 郭佳花, 屈树新, 段晓杰, 徐丽明

单位：1.中国食品药品检定研究院,北京 102629; 2.西南交通大学生命科学与工程学院,成都 610031; 3.西南交通大学材料科学与工程学院,成都 610031

摘要：目的:建立猪细小病毒（PPV）的细胞培养结合荧光定量PCR（ICC-qPCR）方法并进行优化,结合传统的病毒滴定（细胞培养法）及ICC-qPCR 方法,考察将其应用于病毒灭活验证研究的可行性。方法:将系列10 倍稀释的PPV 病毒接种于猪睾丸（ST）细胞,分别扩增培养0、12、18、24 h,考察理想的病毒扩增培养时间,确定ICC-qPCR 定量检测区间及获得病毒扩增倍数（K）;将病毒平行接种于病毒扩增组及非扩增的对照组,通过扩增组和对照组的系列病毒接种量与PCR 反应周期（Ct）值的拟合曲线,分别获得病毒扩增组及对照组的ICC-qPCR 检测病毒滴度（Ta、Tc）,结合扩增倍数（K）,根据公式[Log10（10Ta-10Tc）/（K-1）]直接计算样本中的感染性病毒滴度。最后,将ICC-qPCR、优化ICC-qPCR 方法和细胞培养法分别用于模拟样本（由不同比例感染性病毒和非感染性病毒组成）中的感染性病毒滴度测定,考察将其应用于病毒灭活验证研究的可行性。结果:PPV 接种后的最佳扩增培养时间为24 h,检测下限为-1 Log10TCID50·100 μL-1（Logs）,定量区间为0~5.00 Logs,扩增倍数为83.11。当模拟样本中的非感染性病毒含量较低或与感染性病毒等量时,ICC-qPCR、优化ICC-qPCR 方法和细胞培养法测得的感染性病毒滴度没有显著性差异;然而,当模拟样本中的非感染性病毒含量较高时,由优化的ICC-qPCR 方法和细胞培养法测得的感染性病毒滴度分别是1.46、1.50 Logs,二者高度一致,而常规ICC-qPCR 方法测得的结果（1.75 Logs）存在极显著性差异。结论:本研究所优化的ICC-qPCR 方法作为细胞培养法的替代方法,具有用于病毒灭活验证研究的前景。

关键词：猪细小病毒,细胞培养结合荧光定量PCR 方法,替代方法,扩增倍数,病毒灭活验证,病毒滴定,非感染性病毒,假阳性信号,

基金资助：中国食品药品检定研究院中青年发展研究基金（2018C6）