rAAV5基因组滴度测定的数字PCR方法研究*

来源：药物分析杂志2023年第11期北京时间：

作者：郑红梅, 秦玺, 李永红, 于雷, 毕华, 饶春明, 朱留强, 杨靖清, 史新昌, 周勇

单位：中国食品药品检定研究院 卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室,北京 100050

摘要：目的:建立并验证重组5型腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus type 5,rAAV5)基因组滴度测定的数字PCR方法,并对微滴数字PCR方法和芯片数字PCR方法进行比较。方法:分别用不同浓度的SDS和EDTA前处理 r AAV5样品,用微滴数字PCR测其基因组滴度,对病毒样品前处理试剂进行优化;在其他试验条件不变的情况下,分别设置微滴数字PCR的退火温度为60、58、54、52 ℃,以WPRE引物扩增,比较扩增效果,对数字PCR的退火温度进行优化;分别采用微滴数字PCR和芯片数字PCR测定rAAV5的基因组滴度并比较。结果:终浓度为1% SDS和62.5 mmol·L-1 EDTA按1∶1(v/v)的比例混合后前处理rAAV5,测定的基因组拷贝数较高,前处理液裂解效果较好;当退火温度为54 ℃时,微滴数字PCR中阳性微滴和阴性微滴分离效果最好,扩增特异性最强;2种测定结果的试验室内精密度和回收率接近,测定同一裂解样本的结果较为接近(在1个数量级)。结论:初步建立了数字PCR方法并验证,为后续的进一步验证奠定基础。

关键词：重组5型腺相关病毒,基因组滴度,微滴数字PCR,芯片数字PCR,基因治疗,

基金资助：*北京市科学技术委员会资助(Z221100007922015)