rAAV2-ND4注射液基因转录水平的生物学活性检测方法*

来源：药物分析杂志2023年第11期北京时间：

作者：秦玺, 陈龙, 史新昌, 杨靖清, 潘燕群, 于雷, 毕华, 裴德宁, 安怡方, 潘悦, 李响, 周勇

单位：1.中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室, 北京 100050;2.武汉纽福斯生物科技有限公司,武汉 430014;3.西交利物浦大学, 苏州 215123

摘要：目的:建立并验证检测rAAV2-ND4注射液转录水平的生物学活性检测方法。方法:rAAV2-ND4样品(3.0×1010 vg·mL-1,以每孔360 μL)感染HEK293T细胞(3.0×105 cells·mL-1,每孔0.8 mL,37 ℃ 5% 二氧化碳培养预培养24 h)后2 h,加适量培养基继续培养24 h,收集细胞;按细胞总RNA提取试剂盒操作细则提取细胞总RNA(裂解细胞、吸附、去蛋白、去杂质和洗脱);将提取后的细胞总RNA为模板,用qPCR方法分别检测ND4的mRNA Ct值和β-actin内参基因mRNA Ct值。通过同时设立rAAV2-ND4参比品进行平行检测,通过β-actin内参基因和rAAV2-ND4参比品双重校正检测rAAV2-ND4相对于其参比品的生物学活性。对所建立方法进行方法学验证,包括准确性、精密度、线性和专属性等。另考察了3批制品的批间一致性。 结果:qPCR检测ND4 mRNA转录量和参比品校正的方法检测结果提示ND4 mRNA与rAAV2-ND4感染细胞滴度之间存在量效关系。经方法学验证,方法的检测值与预期值之间偏离率在100%~130%;不同时间不同人员的9次结果RSD为13.75%;rAAV2-ND4滴度在1.0×1010~5.0×1010 vg·mL-1范围内方法线性r>0.97;方法具有很好的专属性。3批rAAV-ND4检测值的RSD为9.3%。结论:初步建立了rAAV2-ND4转录水平的生物学活性检测方法。

关键词：生物学活性,实时定量PCR,内标法,感染,检测,基因治疗,

基金资助：*北京市科学技术委员会资助(Z221100007922015)